連作及栽培料對西藏白肉靈芝三萜的影響

謝榮 韓俊杰 寶麗 劉宏偉

(1 西藏自治區農牧科學院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850000；2 中國科學院微生物研究所，北京 100000）

白肉靈芝Ganoderma leucocontextum是新發現的靈芝品種之一[1]。西藏自治區農牧科學院蔬菜研究所與中國科學院微生物研究所合作開展白肉靈芝活性物質分析與功效研究。自2014年拉薩國家農業科技示范園區馴化栽培白肉靈芝成功后[2-3]，白肉靈芝在拉薩市曲水縣聶當鄉、才納鄉，林芝市巴宜區，工布江達縣巴河鎮，米林縣、波密縣的脫貧攻堅中發揮了重要作用。高效液相檢測發現西藏白肉靈芝中含有26個新三萜化合物，并確立指紋圖譜，且部分活性萜類極具有開發價值[4-8]。白肉靈芝子實體原料品質的好壞，直接影響到活性物質成分等相關產品的質量。因此，有必要對影響白肉靈芝子實體中三萜質量分數及組分的原因進行分析。筆者著重分析連作與不連作、不同栽培料配方對同一種源白肉靈芝子實體中三萜質量分數和組分的影響，為西藏標準化栽培白肉靈芝及其質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為連作與不連作年份、不同栽培料栽培的白肉靈芝子實體。

1.2 試驗方法

每年4月埋菌棒覆土栽培白肉靈芝，9月前完成白肉靈芝采收并清除廢菌棒，次年栽培白肉靈芝前翻耕土壤，清除雜草、石塊，撒石灰澆透水，晴天日光暴曬數日殺菌滅蟲。

1.2.1 連作與不連作對白肉靈芝三萜質量分數和組分的影響

栽培地在拉薩國家現代農業科技示范園區日光溫室，重復5個大棚。栽培料配方為棉籽殼45%，木屑45%，麩皮8%，石灰1%，石膏1%。分析2017年、2018年、2019年三年連作和2020年換土栽培(不連作）的白肉靈芝子實體三萜質量分數及組分。

1.2.2 栽培料對白肉靈芝三萜質量分數和組分的影響

試驗配方6個。配方1：棉籽殼45%，木屑45%，麩皮5%，玉米芯3%，石灰1%，石膏1%；配方2：棉籽殼45%，木屑45%，玉米芯8%，石灰1%，石膏1%；配方3：棉籽殼45%，木屑45%，麩皮8%，石灰1%，石膏1%；配方4：棉籽殼40%，木屑40%，麩皮18%，石灰1%，石膏1%；配方5：河南產35 cm原櫟木段；配方6：河南產25 cm原櫟木段。每個配方3次重復。

1.3 白肉靈芝三萜質量分數及組分的測定

白肉靈芝子實體于50℃的烘箱內脫水，20 h后取出，粉碎，過孔徑0.42 mm的篩備用。

1.3.1 總三萜質量分數測定

1.3.1.1 供試品溶液的制備

精確稱取樣品5.0 g，置于圓底燒瓶內，加入100 mL乙醇，回流提取2 h，濾去濾渣，即得供試品溶液。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

取齊墩果酸對照品20.00 mg，加甲醇定容至100 mL，即得0.20 mg/mL的對照品溶液。

1.3.1.3 顯色方法

靈芝總三萜質量分數的測定采用冰醋酸-香草醛法。精確量取供試品溶液或對照品溶液置于15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精確加入現配的冰醋酸-香草醛溶液(精確稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得。下同）0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴15 min，立即置冰浴5 min，取出，精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應試劑為空白，紫外-可見分光光度法，在波長546 nm處測定吸光度。

1.3.1.4 標準曲線的制備

精確量取對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL，分別置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精確加入新配制的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴15 min，立即冰浴5 min，取出，精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應試劑為空白，紫外-可見分光光度法，在波長546 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=5.4062X-0.0403，相關系數R=0.9995，表明方程擬合度較好。

1.3.2 三萜組分測定

采用高效液相色譜(HPLC）測定白肉靈芝三萜組分。流速：1 mL/min，色譜柱：YMC，C18，250 mm×4.6 mm，高效液相洗脫流程見表1。

表1 高效液相洗脫流程

2 結果與分析

2.1 連作對白肉靈芝三萜質量分數及組分的影響

由表2可以看出，栽培地2017年、2018年連作兩年后2019年再栽培白肉靈芝，其總三萜質量分數下降明顯，由最初的17.1 mg/g下降至15.0 mg/g；2020年換土后栽培的白肉靈芝三萜質量分數又有所上升，為16.8 mg/g。由圖1得出，供試白肉靈芝三萜組分為混源萜類化合物、白肉靈芝特有三萜、傳統赤靈芝三萜、三萜法尼基復合物類。2020年換土后栽培的白肉靈芝各組分三萜的質量分數均高于2017、2018、2019年。HPLC分析結果表明連作栽培白肉靈芝影響其三萜組分。因此，2019年的供試白肉靈芝子實體總三萜質量分數減少與液相圖譜變化均能說明連作障礙是主要原因之一。

圖1 不同栽培年份白肉靈芝子實體三萜組分

表2 不同栽培年份的白肉靈芝總三萜質量分數

2.2 栽培料對白肉靈芝三萜質量分數和組分的影響

由表3可知，配方5、配方6的白肉靈芝總三萜質量分數偏低，配方1、配方2的白肉靈芝中總三萜質量分數較高。由圖2可知，三萜組分中，配方3、配方4的混源萜類化合物和白肉靈芝特有三萜較豐富。配方1、配方2的白肉靈芝特有三萜和傳統赤靈芝三萜較豐富，這與配方1、配方2、配方3、配方4總三萜質量分數較配方5、配方6高的結果一致。

表3 不同配方料栽培的白肉靈芝子實體三萜質量分數

圖2 不同配方栽培白肉靈芝的三萜組分及各組分質量分數

3 小結

試驗結果表明，連作障礙影響三萜質量分數及組分，不同栽培料配方對三萜質量分數影響也較大。配方5、配方6的供試白肉靈芝子實體總三萜質量分數低，但這兩個配方的子實體三萜組分更豐富，各組分質量分數也更高。目前，關于白肉靈芝活性成分與生物活性的研究較多[9-12]，但還需進一步系統比較高效液相分析的白肉靈芝三萜組分變化，這對提升栽培白肉靈芝的品質具有現實意義。