基于傳統分類與ITS序列分析法對真菌的鑒定研究

朱鏈 侯怡鈴 白鑫 楊彤 陳茜 丁祥*

(1 西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000；2 西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637000；3 西華師范大學環境科學與工程學院，四川 南充 637000）

鑒別真菌的傳統方法主要為觀察真菌的形態和微觀特征，輔以生理、生化和營養試驗。但是，對于許多大型真菌來說，如果僅從真菌的形態、生理和生化特性來鑒定，不僅要求鑒定者有豐富的真菌鑒定工作經驗，同時還要花費大量的時間。尤其對于某些生長條件特殊的、形態相似性高的真菌，如果僅僅通過傳統的表型特征來識別，通常會產生假陽性或假陰性結果，較難區分[1]。當今核酸分子生物學技術已應用于各學科。真菌核酸基因組中有4個編碼核糖體RNA的基因(rDNA），該序列高度保守，并包含可變區和高變區。編碼rRNA的核苷酸序列隨時間變化非常緩慢，可用于相對較遠生物體的進化比較。因此對rDNA的序列分析可用于鑒定未知分子量或驗證表型鑒定結果[2-5]。筆者參照文獻從形態特征對來自四川省宜賓市老君山的6株真菌和四川省甘孜藏族自治州雅江縣的6株真菌進行初步鑒定，并用rDNA-ITS序列分析法對菌株的宏觀鑒定做補充和修正。

1 材料與方法

1.1 真菌樣本采集地概況

雅江縣位于四川省甘孜藏族自治州，地處青藏高原東緣的高山峽谷與草原的過渡帶，地形復雜，形成了獨特而神奇的自然景觀，且豐厚的土壤也為許多真菌提供了理想的生長環境。真菌樣本采集地海拔4 218 m，北緯29°41.902′，東經101°09.4208′。

老君山位于四川省南部，有較原始的森林植被。該地雨量充沛，光照適宜，土壤有機質豐富，適宜真菌生長。真菌采集地海拔1 193 m，北緯27°50′，東經103°36′。

1.2 試驗材料

真菌樣品于2019年8月采集于四川省宜賓市老君山(標記為13號、14號、15號、19號、20號、24號）和四川省甘孜藏族自治州雅江縣(標記為Y30號、Y31號、Y41號、Y46號、Y61號、Y83號）。采集真菌過程中記錄其生長環境、生長習性，拍照，然后將其晾干帶回西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，儲存于-80℃冰箱。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix(武漢天一輝遠生物科技有限公司），DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒(天根生物科技有限公司），PCR引物(成都生工生物技術有限公司），乙醇等化學試劑(成都金山化學試劑有限公司），ddH2O(實驗室自制）。

1.4 主要儀器

臺式離心機Mikro 120(北京博瑞祥騰科技有限公司），PCR儀Thermal Cycler 2720(Applied Biosystem美國應用生物系統公司），電泳儀DYY-6 C(北京六一儀器廠），紫外分析儀Gel DocTMXR+(BIORAD伯樂生命醫學產品有限公司），ABI 3730 3730 XL(Applied Biosystem美國應用生物系統公司）。

1.5 試驗方法

1.5.1 傳統分類法鑒定

根據12株真菌菌株形態學特征，參照《中國大型真菌彩色圖譜》[6《]中國大型菌物資源圖鑒》[7《]中國真菌志》[8]鑒定其種屬。

1.5.2 真菌總DNA提取

取10 mg樣品菇體，將其剪碎，迅速加入液氮研磨成粉狀，之后轉移至2 mL離心管，65℃水浴30～40 min，然后加入800 μL體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇溶液，搖勻靜置15 min，12 000 g離心10 min。將上清液轉移至滅菌離心管中，加入1 mL 95%冰凍乙 醇，用 手 輕 搖2 min，-20℃冷 凍 至 少0.5 h，12 000 g離心10 min，棄上清液，加入1 mL 70%乙醇，靜置5 min，12 000 g離心10 min，棄上清液。在潔凈工作臺中干燥沉淀物，再溶于50 μL TE緩沖液中提取總DNA，并放入-20℃冰箱保存以待擴增。

1.5.3 真菌基因組ITS序列PCR擴增

PCR擴增參考文獻[9]。

1.5.4 PCR結果檢測

取擴增反應產物7.0 μL并與6×Loading Buffer混勻，在含有10 mg/mL Gold View 3%的瓊脂糖凝膠上點樣，于1.0×TAE緩沖液(電壓為120 V）中電泳。電泳結束后取出凝膠放在凝膠成像系統中，觀察并拍照。

1.5.5 ITS片段純化以及測序

根據PCR電泳的結果，將500～700 bp的目的條帶用無菌手術刀切下，并用凝膠回收試劑盒回收純化，將純化后的PCR產物送北京奧維森基因科技有限公司進行上下游引物雙向測序，得到測序結果。

1.6 進化樹的構建

將測序結果利用BankIt工具上傳至GeneBank，獲得登錄號，選擇其中最短的擴增序列，以此長度為基本比對長度，在NCBI(National Center for Biotechnology Information）數據庫尋找登記序列中含有與12種真菌樣品序列相似度高的片段，通過BLAST工具和DNAMAN軟件對序列進行分析，截去兩側擴增差異較大的堿基對，使比對的序列大小幾乎一致，重新用Clustalx軟件進行完全比對，用MEGA7.0軟件采用鄰位相連法(N-J，neighbor-joining）構建系統進化樹[10-12]。

2 結果與分析

2.1 傳統分類法的初步鑒定結果

采集的12株真菌菌株形態特征如圖1。根據其生境形態特征(菌蓋、菌環、菌褶、菌柄等）及文獻[6-8]初步鑒定：13號為黏滑菇Hebeloma；14號、15號、19號和20號為粉褶菌Entoloma；24號為球蓋菇Hy?pholoma；Y30號、Y31號、Y41號、Y46號、Y61號、Y83號均為絲膜菌Cortinarius。

圖1 12株真菌生境形態特征

2.2 PCR擴增結果

提取12株真菌菌株總DNA，進行PCR擴增，其rDNA-ITS的PCR擴增產物進行凝膠電泳后均能擴增出目的條帶，擴增產物分子量均在500～750 bp(圖2）。

圖2 12株真菌菌株的rDNA-ITS PCR擴增電泳圖

2.3 DNA-ITS序列測序與比對結果

將12種真菌樣品的擴增測序結果上傳至Gene-Bank，獲得其登錄號。13號樣品登錄號為PW911200963，14號樣品登錄號為PW911130573，15號樣品登錄號為PW911130578，19號樣品登錄號為PW911151178，20號 樣 品 登 錄 號 為PW 911151190，24號樣品登錄號為PW911200959，Y30號樣品登錄號為NR131871.1，Y31號樣品登錄號為NR153055.1，Y41號樣品登錄號為NR154868.1，Y46號樣品登錄號為NR153055.1，Y61號樣品登錄號為NR131871.1，Y83號樣品登錄號為NR154868.1。將樣品序列與從GeneBank獲取的相似較高序列經DNA-MAN和Clustalx軟件比對分析，并用MEGA7構建N-J系統發育樹(圖3）。根據系統發育樹并結合各比對指標來確定距離與相似性均具有較大鑒定意義的比對序列[13-15]。13號(PW911200963）與Hebeloma limbatum(Bull.）Quél.的相似性達99%；14號(PW911130573）、15號(PW911130578）與奧米粉褶菌Entoloma omienseE.HoraK.相似性達99%；19號(PW911200963）與灰粉褶菌Entoloma ameidesFr.相似性達99%；20號(PW911151178）與白方孢粉褶菌Entoloma murrayialbusLiu相 似 性 達99%；24號(PW911200959）與簇生黃韌傘Hypholoma fascicu?lareQuél.相似性達99%；Y30號(NR131871.1）與布里絲膜菌Cortinarius bulliardii相似性達99%；Y31號(NR153055.1）與Cortinarius ferrugineifolius相似性達99%；Y41號(NR154868.1）與Cortinarius decipiens相似性達99%；Y46號(NR153055.1）與Cortinarius hinnuleocervinus有較高的相似性；Y61號(NR131871.1）與布里絲膜菌Cortinarius bulliardii有較高相似性；Y83號(NR154868.1）與Cortinarius de?cipiens相似性達99%。

圖3 12株真菌菌株的rDNA-ITS序列的N-J系統發育樹

3 小結與討論

采用傳統分類與分子生物學相結合的方法鑒定采自四川省宜賓老君山6株真菌菌株，四川省甘孜藏族自治州雅江縣6株真菌菌株，結果表明，傳統分類法與rDNA-ITS序列分析法鑒定結果一致。

傳統分類結合現代分子技術是鑒定真菌種類非常重要的方法。在應用傳統分類法鑒定時需要鑒定者準確分析真菌的形態特征并依據真菌鑒定圖譜找到可能的真菌種類，因此傳統分類法要求鑒定者有豐富經驗，鑒定真菌難度較高。分子序列相似性分析比較盡管更有參考作用，但不同物種之間的ITS序列差異越來越小，因此僅依靠分子生物學方法也不能準確鑒定出真菌的種類，所以分子序列分析與傳統的分類方法相結合才能更準確鑒定種屬，也更客觀。