基于ITS和nLSU序列的木耳屬物種鑒定

牛宇 徐全飛 聶建軍 潘保華 馮婉君 蒙秋霞 趙悠悠

(1 山西農業大學農業經濟管理學院，山西 太原 030006；2 山西農業大學資源環境學院，山西 太原 030031；3 山西省侯馬市出入境檢驗檢疫局，山西 臨汾 043000）

木耳屬Auricularia的物種是食用歷史悠久的食藥用菌，早在1 400多年前我國人民就開始人工栽培食用木耳[1]。據《神農百草經》記載，木耳“益氣不饑，輕身強志”。木耳屬主要栽培品種為黑木耳和毛木耳。根據中國食用菌協會統計，2018年我國黑木耳產量達674萬t，占全國食用菌總產量的17.54%，主要產區為東北三省、河北省、山西省、陜西省、云貴川三省[2]。我國木耳屬種質資源豐富，《中國食用菌名錄》記載有13種，但我國具體有多少種木耳仍存在爭議。山西省為木耳主要產區，因此對其木耳屬栽培菌株和野生菌株進行物種鑒定，有助于研究木耳種質資源的多樣性，也為木耳屬種質資源的收集、評價、利用提供分子數據支撐。此外，野外環境中如黑耳屬等部分銀耳科物種的擔子果外觀形態與木耳屬物種十分相似，但食毒不明，所以有必要借助形態學觀察和分子系統學方法加以區別。

近年來，隨著分子標記技術的發展和應用，木耳屬物種的遺傳多樣性研究取得了長足的進步。吳芳等[3-4]結合ITS+nLSU+rpb2序列鑒定和形態學觀察，研究了黑木耳復合群和氈毛木耳復合群的系統發育和多樣性。張丹等[5]對5個人工栽培毛木耳菌株和2個野生分離的毛木耳菌株進行了ITS序列分析。陶鵬飛等[6]利用ITS和SRAP標記對黑龍江省境內采集的14株野生黑木耳菌株和1個南方栽培菌株進行遺傳多樣性分析。賈定洪等[7-8]對19個毛木耳栽培菌株和3個野生分離菌株進行了ISSR分析和基于ITS序列的系統發育研究。劉華晶等[9]借助ISSR和ITS分子標記對黑龍江省內部分野生黑木耳菌株進行了遺傳多樣性分析。劉虹等[10]對來自山西省木耳屬9份人工栽培菌株和7份野生菌株進行基于ITS片段鑒定，鑒定出3個木耳屬物種，即黑木耳A.heimuer、短毛木耳A.villosula和毛木耳A.cornea，但沒有匹配到文獻記錄山西省有分布的木耳A.auricula、多毛木耳A.polytricha和皺木耳A.delicata。由于木耳屬種類較多，且其子實體的形態、顏色、大小及子實層的形態常隨生長環境及著生部位的不同而變化，因此同物異名或同名異物的情況時有發生[11]。當前人們應用分子生物學和遺傳學新技術，通過對DNA等遺傳物質的比較，可從分子層面鑒定木耳屬物種并探索其進化關系。筆者基于ITS和nSLU序列，結合形態學觀察，對7份山西省木耳屬栽培菌株和4份野生菌株進行鑒定，以期更好地對山西省木耳屬和部分形態近似的野生銀耳科物種進行鑒別和分類，為進一步開發利用該物種資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養基

供試菌株共11個，其中7個菌株為山西省常見木耳栽培品種，4個為野生菌株，于2018—2019年采集(表1）。供試菌株均用組織分離法獲得純培養物，擔子果標本保存于山西農業大學農業資源與經濟研究所食用菌實驗室。

表1 供試菌株及來源

PDA固體培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，硫酸鎂0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，瓊脂2%，pH自然。

1.2 試劑與儀器

DP302基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶，10×Buffer和6×Loading Buffer(北京天根生化科技有限公司）；PCR引物(上海派森諾生物技術有限公司）；脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP）[寶日醫生物技術(北京）有限公司]；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(杭州Axygen生物技術有限公司）；Marker Plus(DL2000 Plus）(北京康潤誠業生物科技有限公司）；核酸染料和RNaseA(北京索萊寶科技有限公司）。

Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司）；Applied Biosystems ABI-2720PCR儀，ABI 3730XL測序儀(上海愛普拜斯應用生物系統貿易有限公司）；Major Science Mini Pro 300 V Power Supply電泳儀(上海珩璟科技有限公司）；Labnet Sub System 70電泳槽(北京百奧創新科技有限公司）。

1.3 菌絲體的培養與收集

將各菌株純培養物接入PDA培養基，培養6 d后用滅菌的手術刀片在不同菌株的菌落表面刮取少許菌絲，置于2.0 mL的離心管中，編號備用。

1.4 DNA的提取

提取樣品DNA，并電泳，得到DNA電泳條帶。

1.5 PCR擴增及測序

選用5條特異引物對11個菌株的DNA進行特異性擴增(表2）。50 μL反應體系成分：20 ng/μL基因組DNA、10×Buffer(含2.5 mmolL Mg2+）、5 U/μL Taq DNA聚 合 酶、10 mmolL dNTP、10 μM引 物、ddH2O。ITS序列PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min，95℃變 性30 s，58℃退 火45 s，72℃延 伸1 min30 s，共34個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。nLSU序列PCR擴增反應條件：95℃預變性1 min，95℃變 性30 s，50℃退 火1 min，72℃延 伸90 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。反應完成后，取3 μL PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。回收、純化后PCR產物送上海派森諾生物技術有限公司，在ABI 3730XL測序儀上進行DNA測序。

表2 試驗所用的基因片段及其對應引物和引物序列

圖1 供試菌株子實體

1.6 ITS和nLSU序列分析

用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI核酸數據庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中的數據比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息。

1.7 構建系統發育樹

將供試標本及來自GenBank登錄木耳屬、黑耳屬、銀耳屬的54個菌株ITS序列、ITS+nLSU序列用Clustal X軟件進行多序列比對分析，并用MEGA5.0軟件中的鄰接分析(Neighbor-Joining，NJ）法構建系統發育樹，Bootstrap檢驗1 000次。

2 結果與分析

采用特異性ITS引物對供試菌株DNA進行PCR擴增，獲得約650 bp的單一條帶(圖2、圖3）；采用特異性nLSU引物對供試菌株DNA進行PCR擴增，獲得約1 000 bp的單一條帶(圖4），條帶清晰明亮，無雜帶、拖尾現象，擴增質量較好。

圖2 供試菌株的ITS1-PCR凝膠電泳圖

圖3 供試菌株的ITS 5/4-PCR凝膠電泳圖

圖4 供試菌株的nLSU-PCR凝膠電泳圖

基于ITS+nLSU序列構建了木耳屬系統發育樹(分支上的數字為用Bootstrap分析獲得的支持值）。如圖5所示，11份菌株聚在5個不同的末端分支。11份菌株的形態特征見表3。

圖5 基于ITS和nLSU序列的菌株和相關種屬的木耳屬系統發育樹

表3 供試11個菌株子實體形態特征

樣本1、2、3、4、5、6與黑木耳A.heimuer的可信樣本序列聚為一支，自舉值為98%，結合擔子果耳狀、子實體層被毛少等特征，以及BLAST結果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性均在99.28%～100.00%），可以確定這些樣本為黑木耳A.heimuer。

樣本7聚在毛木耳A.cornea分支中，自舉值為76%，結合其擔子果褐色或紅褐色、厚而堅韌、不孕面被明顯長柔毛的形態特征，以及BLAST結果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為99.82%、99.49%和99.93%），可以確定該樣本為毛木耳A.cornea。

樣本8也聚在毛木耳A.cornea分支中，自舉值為39%，結合其擔子果紅褐色并帶紫色、杯狀或耳狀、新鮮時膠質不透明、質地粗韌、平滑無皺褶、不孕面具致密長剛毛的形態特征，以及BLAST結果(nLSU序列相似性為99.63%），推測該樣本為多毛木耳A.polytricha。

樣本9聚在短毛木耳A.villosula分支中，自舉值為99%，結合其擔子果黃褐色、新鮮時膠質、杯狀或盤狀、不孕面具明顯短柔毛的形態特征，以及BLAST結果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為99.82%、98.81%和99.78%），可以確定該樣本為短毛木耳A.villosula。

樣本10聚在黑耳屬分支中，自舉值為100%，結合其擔子果墊狀、平展貼生、膠質、淺褐色的形態特征，以及BLAST結果(ITS1、ITS5/4、nLSU序列相似性分別為97.96%、98.60%和99.78%），可以確定該樣本為銀耳科葡萄狀黑耳Exidia uvapassa。

樣本11聚在銀耳屬分支中，自舉值為100%，結合其擔子果葉狀、薄、叢生、膠質、淡污桃色或淺荷花色、干后銹褐色的形態特征，以及BLAST結果(ITS1、ITS5/4序列相似性分別為99.82%和99.16%），可以確定該樣本為銀耳科薔薇色銀耳Tremella roseotincta。

3 小結與討論

基于ITS和nLSU序列分析，供試11份菌株中鑒定出4個木耳屬物種，即黑木耳、毛木耳、多毛木耳和短毛木耳。其中7個山西省常見人工栽培木耳菌株中，除菌株7為毛木耳A.cornea外，其余菌株均聚在亞洲本地種黑木耳A.heimuer[4]，可見山西省常見的木耳栽培種多數為黑木耳，這與前人[10]的研究結果相似。黑木耳是亞洲本地種，并被廣泛栽培[12]。毛木耳也是亞洲物種，并在中國廣為栽培[13]，但在供試木耳栽培種中僅占很小的比例。

自2013年以來，多毛木耳A.polytricha被認為是黑色毛木耳A.nigricans的同物異名[14]，檢索真菌索引(Index Fungorum）和MycoBank數據庫得出，該種的現用名為黑色毛木耳A.nigricans。供試的多毛木耳A.polytricha樣本采自山西省沁源縣，為文獻記載的分布區域[15]。依據nLSU序列相似性結果(99.63%）推測供試野生菌株8為多毛木耳A.polytricha，然而其在進化系統樹中并未與來自美國和哥斯達黎加的同物異名種A.nigricans的樣本系列聚為一支，而是被聚在毛木耳一支，但自舉值并不高(39%），且該物種與毛木耳可信樣本的ITS序列相似度僅為97.03%。根據Renske劃定的標準[16]，序列相似度≥99%時，可以判定為同一個種，序列相似度在95%～99%時，可以判定為同一個屬。可見，菌株8可能是一個與毛木耳A.cornea或黑色毛木耳A.nigricans不同的物種，其分類學地位有待于進一步研究。

短毛木耳A.villosula分布于亞洲溫帶和亞熱帶，在中國廣泛分布，并被人工栽培[17]，俄羅斯也有分布[18]，采自山西省中陽縣的野生菌株(菌株9）與其相似，但在人工栽培菌株中未發現。劉虹等[10]在山西省境內采集的2份短毛木耳菌株也均為野生。因此，山西省可能尚未人工栽培該物種。

2個銀耳科物種葡萄狀黑耳E.uvapassa、薔薇色銀耳T.roseotincta為山西省首次記錄種。其中，葡萄狀黑耳Exidia uvapassa為銀耳科黑耳屬真菌，已被發現分布于韓國東南部[19]、中部[20]及日本[21]；薔薇色銀耳Tremella roseotincta也屬于銀耳科銀耳屬，分布于中國、日本[22]、俄羅斯[23]，其形態與氈蓋銀耳Pha?eotremella fuscosuccinea(Tremella fuscosuccinea）非常相似，區別在于薔薇色銀耳生長于落葉樹上，目前其真菌宿主尚不清楚，生態偏好也需進一步研究[24]。