MMP3在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

戎銀芳，趙玲娜，宗剛軍，趙海濱△

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第904醫院病理科，江蘇無錫 214044；2.蘇州市中西醫結合醫院病理科，江蘇蘇州 215101；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第904醫院心內科，江蘇無錫 214044)

肺癌是呼吸系統常見的惡性腫瘤，發病率和病死率均位居世界前列，其中約85%為非小細胞肺癌(NSCLC)。大多數肺癌患者確診時已是中晚期，其5年生存率不到20%，即使經過手術治療仍容易轉移和復發[1-3]。腫瘤轉移是一個復雜的多步驟、多環節的級聯反應過程，包括局部侵襲、腫瘤細胞滲入血管和腫瘤細胞黏附等[4]。腫瘤細胞在此過程中破壞基底膜并降解細胞外基質(ECM)，從而實現腫瘤的侵襲和轉移[5-6]。基質金屬蛋白酶3(MMP3)是ECM合成和調節降解代謝平衡過程中存在的關鍵性酶之一，與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關[7-8]。目前關于MMP3在NSCLC中作用的研究甚少，其在NSCLC中的功能尚未闡明。本研究旨在探討MMP3在NSCLC的表達及其可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年1月至2016年12月中國人民解放軍聯勤保障部隊第904醫院NSCLC患者手術切除的腫瘤標本76份(NSCLC組)及癌旁正常組織76份(癌旁對照組)。經兩位有經驗的病理醫師確診為NSCLC，其中男47例，女29例；年齡25～76歲，平均(60.00±12.70)歲；腫瘤直徑小于或等于3 cm者27例，>3 cm者49例；低分化者25例，中分化者49例；高分化者2例；按AJCC第七版臨床分期分為Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期35例；伴有淋巴結轉移者42例，無淋巴結轉移者34例。隨訪主要采用門診復查及電話回訪等形式，隨訪時間1～91個月，失訪者隨訪時間按照截尾數據處理。患者術前均未接受任何輔助治療。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

sc-21732 MMP3抗體購自美國Santa Cruz生物科技公司。

1.2.2IHC檢測和結果判讀

IHC采用Envision兩步法，MMP3鼠抗人單克隆抗體工作濃度為1∶100。由兩位病理醫師對切片進行盲式閱片，從染色細胞的比例(<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分)及染色的深度(無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分)來評定每一個腫瘤組織切片MMP3表達水平。兩項評分相乘得到綜合評分，并分為4個等級：陰性(-，0～1分)，弱陽性(+，>1～4分)，中度陽性(++，>4～8分)，強陽性(+++，>8分)。

1.2.3基因表達綜合(GEO)數據庫分析

從開放的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載NSCLC患者mRNA表達譜的數據集GSE18842、GSE19804和GSE31552，分別包括45例腫瘤樣本和46例癌旁樣本、60例腫瘤樣本和60例癌旁樣本、62例腫瘤樣本和63例癌旁樣本。分析MMP3 mRNA在NSCLC和癌旁組織中的表達變化。

1.2.4基因表達譜動態分析(GEPIA)數據庫分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個用于分析癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中腫瘤和正常樣本RNA表達數據的網站。GEPIA被用來對NSCLC中的MMP3進行生存分析。根據中值將基因表達分層為高表達和低表達，用對數秩檢驗確定MMP3表達對NSCLC生存的意義。

1.3 統計學處理

數據使用SPSS22.0軟件進行統計學分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher概率法。以Kaplan-Meier法建立生存分析模型，組間比較采用Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組標本組織中MMP3表達水平比較

MMP3表達主要定位于細胞質或細胞膜。NSCLC組中MMP3的陽性表達率為80.26%，其中弱陽性10份(13.16%)，中度陽性32份(42.11%)，強陽性19份(25.00%)。癌旁對照組中MMP3的陽性表達率為59.21%，明顯低于NSCLC組(χ2=7.980，P=0.008)，見圖1、表1。

A：NSCLC組織；B：癌旁組織。

表1 兩組標本組織中MMP3表達水平比較[n(%),n=76]

2.2 兩組標本組織中MMP3 mRNA表達水平比較

利用GEO數據庫分析了3組不同數據集(GSE18842、GSE19804和GSE31552)NSCLC組織和癌旁組織中MMP3 mRNA的表達情況，結果顯示，MMP3 mRNA在NSCLC組織中的表達水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05)，見圖2。

2.3 MMP3表達與NSCLC臨床病理的相關性分析

MMP3在NSCLC中的表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移和臨床分期明顯相關(χ2=4.887、6.182、5.106，P<0.05)，而與患者的性別、年齡及腫瘤的病理分級無關(χ2=0.573、0.267、1.408，P>0.05)，見表2。

圖2 MMP3 mRNA在兩組標本組織中的表達

表2 MMP3表達與NSCLC患者臨床病理特征的相關性分析[n(%)]

2.4 MMP3 表達與NSCLC患者預后的相關性分析

利用Kaplan-Meier生存分析MMP3表達與NSCLC患者預后的關系，結果顯示，與MMP3陰性組相比，MMP3陽性組患者的總生存率明顯降低(P<0.05)，見圖3。利用GEPIA數據對MMP3 mRNA表達與NSCLC患者預后的分析結果顯示，MMP3 mRNA高表達的患者總生存時間明顯低于MMP3 mRNA低表達的患者(P<0.05)，見圖4。

圖3 MMP3表達水平與NSCLC患者預后的關系

圖4 MMP3 mRNA表達與NSCLC患者預后的關系

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，分別占全球男性和女性新發惡性腫瘤的第一位和第二位，其發病率和病死率一直居高不下。據統計，全球每年約有160萬新發肺癌患者[9-11]。因此，肺癌嚴重威脅著人類的健康。近年來，雖然對肺癌的診斷和治療都取得了一定的進展，但是，由于肺癌的發生、發展和轉移的過程非常復雜，有諸多基因和蛋白參與調控，因此，肺癌惡性進展和轉移的具體機制尚未闡明。

組織的ECM和基底膜是阻止腫瘤入侵和轉移的天然屏障。ECM的退化和基底膜完整性的喪失會導致腫瘤的侵襲和轉移。MMPs是關鍵的蛋白分解酶，能夠通過降解ECM和基底膜促進癌細胞侵入周圍組織，與惡性腫瘤的浸潤和轉移密切相關[12]。MMP3是MMPs超家族的主要成員之一，主要由結締間質細胞、成纖維細胞、毛細血管內皮細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞產生，能降解基底膜、蛋白多糖、層黏連蛋白、纖維蛋白和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原蛋白等多種蛋白多糖或糖蛋白[13-14]。MMP3能通過剪切基質分子核心蛋白聚糖來釋放轉化生長因子β1(TGF-β1)，釋放的TGF-β1對腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移、分化及免疫功能都具有重要的調控作用，從而產生廣泛的生物學效應。與其他MMPs不同，MMP3主要的功能是激活其他類型的MMPs，如MMP2和MMP9[15-16]。

對胃癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的研究結果表明，MMP3在乳腺癌、胰腺癌和胃癌中高表達，且其表達可以作為預測腫瘤患者生存時間的生物標志物[8,17]。既往研究發現，腫瘤中的MMP3水平與MMP9活性密切相關，脂肪細胞外泌體上的MMP3能夠激活MMP9的活性，并促進惡性腫瘤的侵襲和轉移[18]。本研究結果表明，與癌旁組織相比，MMP3 mRNA和蛋白在NSCLC中的表達明顯升高，且NSCLC中MMP3表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移和臨床分期呈明顯的正相關性。此外，IHC檢測結果顯示，MMP3陽性的NSCLC患者總生存率明顯低于MMP3陰性的患者。來源于TCGA的數據也表明，MMP3 mRNA高表達的患者總生存時間明顯低于MMP3 mRNA低表達的患者。以上的結果表明，MMP3與NSCLC的發生、發展、分化程度、轉移及預后密切相關。檢測NSCLC組織中MMP3的表達，在預測NSCLC的發展、轉移和復發風險等具有重要的臨床意義。因此，MMP3有望成為NSCLC治療的潛在靶標。

綜上所述，NSCLC組織中MMP3表達上調與NSCLC患者的預后以及多個臨床特征如腫瘤直徑、淋巴結轉移和臨床分期密切相關，可能促進NSCLC的惡性進展和轉移，其表達水平可能作為NSCLC預后預測的重要指標。然而，關于MMP3在NSCLC中具體的生物學機制尚不清楚，有待于進一步研究。