七氟醚麻醉對胃癌大鼠認知功能的影響及機制研究

程亮亮，田 毅，黃運伯,魏 曉

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院麻醉科，海口 570208)

現階段，胃癌已逐漸成為嚴重威脅人們生命健康的重要疾病之一。中國胃癌患病率占全球胃癌發病的42.6%，病死率占45.0%，為癌癥防治重點[1]。胃癌根治性手術仍為胃癌治療首選方法，可為下一步綜合治療提供依據和時間[2]。但多數胃癌患者易出現術后認知功能障礙(POCD)，臨床表現包括注意力減退、記憶力減退、社交能力下降等，多發于術后48 h內，部分患者癥狀可持續7 d至數月。POCD一直是影響胃癌患者術后康復效果的關鍵，且臨床尚無防治POCD發生的特別有效的措施。近年來，吸入型麻醉藥物在POCD發生中的作用，逐漸引起較多學者關注，其中七氟醚備受關注，主要是因其雖具有起效快、麻醉效果強、可減少圍術期血流動力學波動等特點，但對術后認知功能影響尚不明確。NELLORE等[3]認為，七氟醚可引發生理應激反應，影響認知功能，但這一影響是暫時性的。李繁等[4]經動物實驗發現，七氟醚可能通過誘導中樞神經系統炎性反應、氧化應激反應等，引發大鼠認知損傷。另外，神經細胞凋亡可受氧化應激反應、炎性反應影響，進而誘導神經細胞功能退化，引發POCD[5]。但目前臨床就七氟醚吸入麻醉是否參與胃癌患者POCD發生發展過程尚無明確定論。因此，本研究創建胃癌大鼠模型，重點分析七氟醚麻醉對POCD的影響，以探尋有效的麻醉方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選取50只健康雄性SD大鼠[湖南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(湘)2016-0001]，體重250～300 g，8周齡，在22～25 ℃、清潔環境中適應性喂養3 d，每日光照及黑暗時間各12 h。動物處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》[6]。本實驗已通過該院倫理委員會審核。

1.1.2儀器與試劑

SSC600沉降離心機(張家港市遠華機械制造廠)，JP-420電熱恒溫干燥箱(武漢市武昌實驗儀器廠)，-80 ℃冰箱(美國Thermo scientific公司)，4 ℃冰箱(德國西門子股份公司)，ZH00 65型Morris水迷宮系統(成都泰盟軟件有限公司)，GDS800凝膠圖像分析軟件(美國UVP公司)，七氟醚(批號：20000102，日本Mukhi公司)，二氨基聯苯胺(DAB)液(美國Sigma公司)，羊抗兔IgG抗體(美國Santa Cruz公司)，戊巴比妥鈉(美國Epitomics公司)，肌氨酸乙酯亞硝胺(NSEE)、亞硝酸鈉致癌劑(美國Sigma公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、淀粉樣前體蛋白(APP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海瀘尚生物科技有限公司)，兔抗大鼠膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、半胱氨酸天冬氨酸酶-9(caspase-9)單抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立及分組

50只大鼠按照體重分組法分為A、B、C、D、E 5組，每組10只。除A組外，其余4組參照文獻[7]采用NSEE(2.00 g/kg)和亞硝酸鈉(0.30 g/kg)混合灌胃，建立胃癌大鼠模型，每天1次，持續3個月。各試驗結束后，行病理組織學鑒定，經手術取胃小彎體-竇交界處胃黏膜，光鏡下檢查，觀察存在胃黏膜腸上皮化生病變，即為建模成功。40只大鼠建模成功33只(82.50%)，剔除未建模成功大鼠后，B、C、D、E組分別有8、8、9、8只大鼠納入研究。A組以等量生理鹽水灌胃，持續3個月，10只大鼠均納入研究。

1.2.2手術及麻醉

建模成功后2周。A組給予生理鹽水腹腔注射；B組以100 mg/kg丙泊酚腹腔注射麻醉誘導，C、D、E組分別以1%、2%、3%七氟醚吸入麻醉誘導，均行腹部探查術，手術時間為2 h，術中常規吸氧，術后給予頭孢曲松鈉腹腔注射預防感染。七氟醚吸入載體為純氧，吸氧流量為2 L/min。

1.2.3Morris水迷宮測試

術后第7天開始，各組大鼠均行水迷宮測試。每天晚21:00開始，持續5 d。第1～4 天實施定位航行實驗，第5天實施空間探索實驗，維持水溫(24±2)℃。(1)定位航行實驗：大鼠面朝池壁推入水中，頭保持同側，觀察并記錄其尋找平臺時間，計算逃避潛伏期(入水至找到隱藏在水面下平臺的時間)、目標象限游泳距離(大鼠在目標象限內的游泳距離)，以評估認知功能中學習能力。針對超過2 min未找到平臺者，逃避潛伏期按照2 min計算。(2)空間探索實驗：完成定位航行實驗24 h后，保持參數不變，平臺撤去。入水點為第1象限，大鼠推入水內，觀察并記錄其2 min內運動軌跡、穿越平臺次數，以評估認知功能中記憶能力。

1.2.4海馬組織標本采集

水迷宮測試完成后，各組大鼠以40 mg/kg注射6%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭處死。冰袋上覆蓋無菌錫箔紙，快速分離大鼠海馬組織，液氮冷凍存24 h后，置于-80 ℃冰箱內冷凍保存。

1.2.5ELISA檢測海馬內SOD、丙二醛、APP水平

海馬組織按照2.50 mL/g腦質量，加入相當體積生理鹽水，勻漿器研磨，超聲波粉碎制備勻漿。4 ℃條件下，12 000 r/min，離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液。嚴格按照試劑盒使用說明書檢測SOD、丙二醛、APP。標準品、稀釋樣品置于反應孔，封板膠紙密封，輕輕搖晃，置于37 ℃孵育箱，持續孵育60 min。洗滌各孔，干燥，重復5次。滴入AB顯色液，避光，置于37 ℃孵育箱，觀察10 min顯色完成后，加入終止液，反應5 min。10 min內觀察并讀取吸光度(A)值。以A值為縱坐標，以標準液濃度為橫坐標，創建濃度標準曲線，按照A值獲得樣品濃度。

1.2.6Western blot法檢測海馬組織GFAP、TNF-α、caspase-9表達

海馬組織按照1∶10 g/L比例加入蛋白提取試劑，勻漿器研磨，超聲波粉碎制備勻漿。4 ℃條件下，離心半徑10 cm，12 500 r/min，離心15 min，取上清液。采用BCA法進行蛋白定量，按照目的蛋白相對分子量實施十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質轉膜。封閉溶液為5%脫脂牛奶，37 ℃條件下，輕搖2 h，分別加入GFAP、TNF-α、caspase-9進行雜交反應。4 ℃，輕搖，過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜，每次5 min，共3次。滴加羊抗兔IgG抗體，進行雜交反應。37 ℃條件下孵育，共1.50 h。PBS洗膜，每次5 min，共3次。發光劑顯影，X射線膠片曝光，GDS800凝膠圖像分析系統行半定量分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠水迷宮測試結果比較

定位航行實驗第1天時，5組大鼠組間逃避潛伏期、目標象限游泳距離比較，差異無統計學意義(P>0.05)。定位航行實驗第4天時，各組間逃避潛伏期、目標象限游泳距離比較，差異有統計學意義(P<0.05)；5組大鼠逃避潛伏期、目標象限游泳距離均短于第1天(P<0.05)；A、B、C、D、E組大鼠組間逃避潛伏期、目標象限游泳距離逐漸延長(P<0.05)。空間探索實驗中，A、B、C、D、E組大鼠組間穿越平臺次數逐漸減少(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠水迷宮測試結果比較

2.2 各組大鼠海馬內SOD、丙二醛、APP水平比較

A、B、C、D、E組大鼠組間SOD水平呈逐漸下降趨勢，丙二醛、APP水平呈逐漸增高趨勢，各組大鼠組間SOD、丙二醛、APP水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 各組大鼠海馬內GFAP、TNF-α表達水平比較

Western blot法檢測結果顯示，A、B、C、D、E組大鼠組間GFAP、TNF-α相對表達水平呈逐漸增高趨勢，各組大鼠組間GFAP、TNF-α相對表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.4 各組大鼠海馬組織caspase-9表達水平比較

Western blot法檢測結果顯示，A、B、C、D、E組大鼠組間caspase-9相對表達水平逐漸增高，各組間caspase-9相對表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2 各組大鼠海馬內SOD、丙二醛、APP水平比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較；d：P<0.05，與D組比較。

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較；d：P<0.05，與D組比較。

3 討 論

POCD在重大手術患者中較常見，與高齡、手術時間長、炎性反應、高血壓、心理因素等有關[8-10]。胃癌患者出現POCD，可引發記憶力受損、認知功能低等，嚴重影響術后生存質量。近年來，隨著對POCD研究的不斷深入，認為麻醉藥物選擇可能是影響POCD發生的重要因素。七氟醚在多種疾病全身麻醉誘導及麻醉維持中發揮重要作用，具有麻醉作用強、起效快、對氣道刺激小等特點。但目前臨床就胃癌大鼠中七氟醚麻醉對認知功能影響分析仍較少，尚未達成一致意見。有研究認為，1.3%七氟醚預處理對局灶性腦缺血大鼠具有腦保護作用[11]。但也有研究提出，七氟醚吸入麻醉是引發大鼠認知功能損傷的一個重要因素[12]。因此，進一步分析七氟醚對認知功能影響，明確其與POCD發生的關系，以指導臨床合理應用，具有重要意義。

本研究結果顯示，水迷宮測試中定位航行實驗第4天時，各組大鼠逃避潛伏期、目標象限游泳距離均較第1天時減少，這提示隨著水迷宮訓練時間延長，可提升大鼠學習、記憶能力。楊寧等[13]研究中提出，丙泊酚連續麻醉，可經由對海馬區自噬進行抑制，引發老年大鼠空間學習記憶能力損傷。本研究中，B組第4天時逃避潛伏期、目標象限游泳距離上較A組稍增加，穿越平臺次數較A組稍減少，與前述結果相符。ZHAO等[14]認為七氟醚麻醉會給發育中大鼠學習、記憶能力造成影響。本研究結果顯示，各組第4天時逃避潛伏期、目標象限游泳距離明顯延長，穿越平臺次數明顯減少，且C、D、E組逃避潛伏期、目標象限游泳距離隨吸入七氟醚濃度提升而變化，這也說明七氟醚麻醉可能會給大鼠認知學習能力造成一定影響，且隨吸入濃度增加，影響越明顯。

炎性應激反應在POCD中發揮重要作用。SOD能對生物體新陳代謝過程中形成的有害物質進行清除，且在清除氧自由基中作用明顯。丙二醛是反映機體脂質過氧化、細胞損傷程度的重要指標，可參與脂質過氧化發生、發展。APP是一種常見急性反應蛋白，易被分解產生β-淀粉樣蛋白，激活星形膠質細胞，引發氧化應激、炎性反應，是POCD重要病理學過程[15-16]。本研究中，C、D、E組丙二醛、APP水平較A、B組升高，SOD水平降低，說明七氟醚麻醉可引發應激反應，且隨七氟醚吸入濃度增加，應激反應越明顯，可能與七氟醚提升APP表達引發氧化應激反應有關。

本研究還發現，各組大鼠海馬組織GFAP、TNF-α表達水平也存在差異，與A、B組比較，C、D、E組的GFAP、TNF-α表達升高，說明七氟醚麻醉還可誘導炎性反應，且作用呈濃度依賴性。有研究發現，七氟烷有細胞毒性作用，可引發細胞凋亡或損傷，產生POCD[17]。炎性反應與細胞凋亡之間有密切關系，細胞凋亡參與組織內炎性細胞數量調節，而炎性細胞浸潤可誘導細胞凋亡[18]。caspase家族蛋白酶可調控細胞凋亡，其中caspase-9為細胞凋亡起始因子，可在其他蛋白影響下出現自我活化現象，且可激活下游caspase-3，促進細胞凋亡[19-20]。本研究中，C、D、E組caspase-9表達較A、B組高，七氟醚在誘發炎性應激反應同時，也增加了caspase-9表達，且作用呈濃度依賴性，提示七氟醚可能經由誘導炎性應激反應，改變caspase-9表達，促進細胞凋亡，引發POCD；且隨七氟醚吸入濃度增加，對認知功能影響越明顯。本研究結果顯示，雖然七氟醚麻醉可影響胃癌大鼠認知功能，但1%七氟醚麻醉對學習、記憶能力及細胞凋亡的影響較2%、3%七氟醚濃度小，故臨床可按照胃癌患者實際情況合理應用。

綜上所述，七氟醚麻醉可能通過誘導應激反應、炎性反應及促進細胞凋亡，參與胃癌大鼠POCD發生、發展過程，且吸入濃度越高對POCD影響越明顯，故臨床可在保證麻醉效果同時，選擇較小劑量應用。本研究局限在于經動物復制的疾病模型與人體自然條件下出現的疾病可能存在一定差異，無法完全等同，故僅可為七氟醚麻醉在胃癌患者中應用研究提供理論參考。