UBE2T-siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響

劉丹麗，徐建峰，周歡歡，王霖玲，邵喜英△

(1.紹興第二醫(yī)院醫(yī)共體總院腫瘤內(nèi)科，浙江紹興312000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/浙江省腫瘤醫(yī)院乳腺內(nèi)科，杭州 310000；3.浙江省紹興市中醫(yī)院藥劑科 312000)

乳腺癌是全世界三種最常見(jiàn)的癌癥之一，威脅女性健康[1]。有關(guān)乳腺癌發(fā)病病因尚不完全清楚，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乳腺癌的預(yù)后得到了一定程度的改善，但其發(fā)病率仍然在逐年升高[2]。因此，研究可能與乳腺癌發(fā)生有關(guān)的基因，有助于解析乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解途徑，與多種生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路有關(guān)[3]。泛素結(jié)合酶E2T(UBE2T)是UPS系統(tǒng)的重要組成部分，有研究表明，UBE2T在多種腫瘤組織和細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)[4-5]。PEREZ-PENA等[6]研究表明，UBE2T在乳腺癌患者中存在過(guò)表達(dá)，且與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。然而有關(guān)UBE2T對(duì)乳腺癌細(xì)胞影響的研究較少，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA質(zhì)粒，研究UBE2T-siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，為研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、HCC1937及乳腺正常細(xì)胞系MCF-10A(TCHu227、SCSP-531、TCHu136、TCHu148、SCSP-575)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(61870036)、胎牛血清(10099)、青霉素-鏈霉素(15070063)、胰蛋白酶(25200056)，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 3000試劑盒(L3000015)，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNAiso plus(9108Q)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037)、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(RR820Q)，購(gòu)自日本TAKARA公司；單抗細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1，ab16663)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin，ab184919)、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cad，ab76011)、上皮型鈣黏附蛋白(E-cad，ab133597)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9，ab32539)、c-Myc(ab32072)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，ab8245)，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(ST316)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(C1062)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(A0208)、細(xì)胞蛋白提取試劑盒(P0033)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(P0012)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；UBE2T mRNA、GAPDH、UBE2T-siRNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3儀器

多功能酶標(biāo)儀(VarioskanTMLUX，美國(guó)ThermoFisher公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(CFX96，美國(guó)Bio-Rad公司)；蛋白凝膠成像儀(Gel Doc，美國(guó)Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(FACS Canto Ⅱ，美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468、HCC1937、MCF-10A常規(guī)復(fù)蘇，加至含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化，每隔2～3天進(jìn)行1次細(xì)胞傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定對(duì)數(shù)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

取1.2.1中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞MDA-MB-231，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/孔，接種至6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，倒掉培養(yǎng)板中培養(yǎng)液并加入新鮮培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將細(xì)胞分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染試劑)、陰性轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)、UBE2T-siRNA組(轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA質(zhì)粒)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中UBE2T mRNA表達(dá)水平

RNAiso Plus試劑盒提取1.2.1及1.2.2中各組細(xì)胞中RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 60 s，95 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組細(xì)胞中UBE2T mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取培養(yǎng)48 h后各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，配置細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種至96孔板中，并設(shè)置調(diào)零孔，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入20 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT試劑，37 ℃遮光培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/(對(duì)照孔A值-凋零孔A值)]×100%。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡

取培養(yǎng)48 h后各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，配置細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，吸取100 μL細(xì)胞懸液至新離心管中，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕混均勻，4 ℃遮光孵育15 min；加入碘化丙啶(PI)染液，輕混均勻，流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞凋亡情況。吸取100 μL細(xì)胞懸液至離心管中，并加入預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，PBS洗滌2次，加入200 μL PBS，分別加入20 μL的0.05 mg/mL的RnaseA和PI，4 ℃遮光30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期數(shù)據(jù)的收集和分析。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況

取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，配置細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，每組選取3個(gè)重復(fù)，接種于鋪有Matrigel膠的Transwell小室上室，并在下室中加入600 μL含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，倒掉上室培養(yǎng)液，用棉簽擦去未遷移的細(xì)胞和多余的Matrigel膠，無(wú)水甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察染色細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取培養(yǎng)48 h后各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，配置細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔，每組選取3個(gè)重復(fù)，接種至24孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，PBS清洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞，蛋白提取試劑盒對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，BCA試劑盒測(cè)定提取總蛋白濃度，蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉遮光封閉2 h；分別加入一抗稀釋液(CyclinD1 1∶200、β-catenin 1∶1 000、N-cad 1∶1 000、E-cad 1∶5 000、caspase-9 1∶2 000、c-Myc 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液(Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween)洗膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中UBE2T mRNA表達(dá)水平比較

與正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A中UBE2T mRNA表達(dá)水平(1.00)比較，乳腺癌細(xì)胞系中UBE2T mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，HCC1937、MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231中UBE2T mRNA表達(dá)水平分別為1.29±0.08、1.32±0.09、1.53±0.15、1.64±0.13，其中MDA-MB-231表達(dá)水平最高，故選取乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行后續(xù)研究。不同乳腺癌細(xì)胞系中UBE2T的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

A：MDA-MB-231；B：MDA-MB-468；C：MCF-7；D：HCC1937；E：MCF-10A。

2.2 各組MDA-MB-231中UBE2T mRNA表達(dá)水平比較

對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、UBE2T-siRNA組細(xì)胞UBE2T mRNA表達(dá)水平分別為1.00、1.02±0.06、0.54±0.13，與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組比較，UBE2T-siRNA組細(xì)胞UBE2T mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；各組MDA-MB-231中UBE2T的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：UBE2T-siRNA組。

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率比較

與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組比較，UBE2T-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均明顯升高(P<0.05)；見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率比較

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期百分比比較

與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組比較，UBE2T-siRNA組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低，G2/M期細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)；各組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖4。

2.5 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況，對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、UBE2T-siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(219.62±21.48)、(198.54±18.67)、(89.65±16.74)個(gè)，與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組比較，UBE2T-siRNA組組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

表3 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期百分比比較

A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：UBE2T-siRNA組。

A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：UBE2T-siRNA組。

A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：UBE2T-siRNA組。

2.6 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組比較，UBE2T-siRNA組細(xì)胞蛋白CyclinD1、c-Myc、β-catenin、N-cad表達(dá)水平明顯降低，E-cad、caspase-9表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖6。

表4 各組細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)水平比較

續(xù)表4 各組細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)水平比較

A：對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：UBE2T-siRNA組。

3 討 論

乳腺癌是威脅婦女健康的殺手，其發(fā)病涉及環(huán)境、基因、飲食習(xí)慣等多方原因。臨床治療主要通過(guò)手術(shù)、放化療等，但不可避免使患者喪失乳房完整性，且后續(xù)治療對(duì)身心均有不利影響，因此持續(xù)探究乳腺癌發(fā)病機(jī)制有益于豐富臨床治療方案[3]。UPS系統(tǒng)包括泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)，以及蛋白酶體及其底物蛋白，E1激活Ub C末端，生成硫酯連接的E1-Ub結(jié)合物，之后通過(guò)轉(zhuǎn)硫反應(yīng)活化的Ub與E2結(jié)合，并通過(guò)E3連接至底物蛋白上，不僅能夠改變蛋白質(zhì)的位置、功能，還能影響細(xì)胞周期和癌癥等相關(guān)過(guò)程[7]。UBE2T屬于泛素結(jié)合酶家族，是一種致癌蛋白，UBE2T能夠催化Ub與蛋白底物的連接，在癌癥中有重要作用[8]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞系中UBE2T mRNA明顯高于正常乳腺細(xì)胞，提示UBE2T可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。4個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中MDA-MB-231的UBE2T mRNA表達(dá)最高，因此選取MDA-MB-231進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

LUO等[9]研究表明，UBE2T在胃癌中有關(guān)鍵作用，UBE2T-siRNA能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制UBE2T的表達(dá)能夠抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的形成和生長(zhǎng)。ZHENG等[10]研究結(jié)果表明，UBE2T在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常組織和細(xì)胞，且UBE2T過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞MIApaca-2，Bxpc-3的增殖、遷移和侵襲，而UBE2T下調(diào)抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。羅何三等[11]研究表明，乳腺癌組織中UBE2T mRNA表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，且與患者臨床病理特征有關(guān)，是乳腺癌預(yù)后的不良因素，而UBE2T對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響還少有研究。本研究結(jié)果表明，沉默UBE2T能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞凋亡率及G2/M期細(xì)胞百分比，降低G0/G1期細(xì)胞百分比，說(shuō)明UBE2T可能是乳腺癌發(fā)展過(guò)程中的癌基因。LIU等[12]研究表明，抑制UBE2T的表達(dá)能夠?qū)⒏伟┘?xì)胞SMCC-7721和Huh-7阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞的增殖，猜測(cè)沉默UBE2T可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制MDA-MB-231的增殖，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

caspase家族是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，與真核細(xì)胞的凋亡有關(guān)。caspase-9是一種典型的凋亡蛋白[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T-siRNA組細(xì)胞caspase-9表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明沉默UBE2T能夠促進(jìn)MCF-10A細(xì)胞的凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。β-catenin是一種多功能蛋白，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。LIU等[14]研究表明，沉默UBE2T能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1299等的增殖和侵襲。Wnt是β-catenin的主要調(diào)節(jié)器，當(dāng)Wnt激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子4(TCF4)等調(diào)節(jié)因子結(jié)合，促進(jìn)CyclinD1和c-Myc等蛋白的轉(zhuǎn)錄[15]。CyclinD1能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[16]。c-Myc基因能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，使細(xì)胞無(wú)限增殖，獲得永生化功能，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果表明，UBE2T-siRNA組蛋白CyclinD1、C-Myc、β-catenin的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，猜測(cè)UBE2T可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響CyclinD1、c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。EMT通過(guò)使癌細(xì)胞失去上皮特性和獲得間充質(zhì)表型，被認(rèn)為是促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的主要原因之一[20]。N-cad、E-cad是EMT途徑的典型標(biāo)志物。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，沉默UBE2T能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲，且UBE2T-siRNA組細(xì)胞蛋白N-cad的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而E-cad的表達(dá)升高，說(shuō)明沉默UBE2T可能通過(guò)抑制EMT途徑，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，沉默UBE2T的表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，可能是乳腺癌的潛在研究靶點(diǎn)。然而本研究?jī)H在體外條件下，分析了UBE2T對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的影響，未深入研究具體機(jī)制，是本研究不足之處，下一步需查閱相關(guān)資料，進(jìn)一步探討UBE2T在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。