廣藿香水提液對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化和改善胰島素抵抗的作用

高海云，常仁旭，侯林彤，岳學(xué)青，徐 闖，崔一喆

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

胰島素抵抗(IR)作為我國糖尿病相關(guān)研究的熱點(diǎn)問題，不僅是2型糖尿病(T2DM)發(fā)生的主要病理機(jī)制[1-2]，還與畜牧業(yè)酮病的發(fā)生發(fā)展有密切的相關(guān)性[3]。IR主要表現(xiàn)在脂肪、肝臟和骨骼肌等三大外周組織，其中脂肪是率先發(fā)生IR的部位。脂肪細(xì)胞不僅是脂肪組織的主要成分，而且在調(diào)節(jié)脂肪組織能量穩(wěn)態(tài)和內(nèi)分泌功能中起關(guān)鍵作用[4-6]。而脂肪細(xì)胞分化是形成功能性脂肪以促進(jìn)胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素[7-9]。與脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的基因之一是過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，PPAR可分為α、β(或δ)和γ 3種類型，其中PPARγ主要在脂肪細(xì)胞分化、IR和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(troglitazone,TZDs)作用的靶分子[10]。而在PPARγ的3種亞型中，PPARγ2與脂肪和皮脂腺細(xì)胞的分化有著密切關(guān)系[11]。PPARγ2作為脂肪細(xì)胞分化過程中重要的調(diào)節(jié)因子，它可促使成纖維細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟的脂肪細(xì)胞分化[12]。IR是指機(jī)體對(duì)胰島素敏感性的下降，主要是由肝糖輸出功能增強(qiáng)，脂肪組織和肌肉組織攝取葡萄糖能力減弱所導(dǎo)致[13]。因此調(diào)節(jié)糖脂代謝提高胰島素敏感性，從而改善IR的藥物研究至關(guān)重要。

廣藿香(Pogostemoncablin,PC)又名刺蕊草、南藿香，該品為唇形科植物PC的干燥地上部分[14]。PC是中國和東南亞國家(例如馬來西亞和印度)的重要傳統(tǒng)藥物，具有數(shù)千年的歷史，不僅具有芳香化濁、和中嘔解暑之效,還具有抗病毒活性、抗氧化、抗炎和止痛等方面的重要生物活性[15]。目前PC水提液對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖分化以及調(diào)節(jié)IR效果上尚不明確，本研究通過PC水提液對(duì)3T3-L1前脂肪增殖和分化的影響，以及在IR狀態(tài)下對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，探究PC水提液改善IR的作用。

1 材料與方法

1.1 中藥提取中藥PC購自大慶福瑞邦藥房，稱量好的中藥飲片中加入10倍蒸餾水浸泡過夜后進(jìn)行煎煮提取，加熱至微沸，保持微沸50 min后過濾得中藥液，剩余的藥渣加入8倍量蒸餾水，保持微沸30 min后過濾得中藥液。合并2次藥液，加熱濃縮至生藥質(zhì)量濃度500 g/L，冷卻至室溫，使用0.22 μm的濾器過濾，4℃保存待用。

1.2 材料3T3-L1前脂肪細(xì)胞(上海中科院)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco-BRL公司)；特級(jí)胎牛血清(美國Clark公司)；PBS、油紅O染色液、胰蛋白酶、青鏈霉素(Solarbio公司)；二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松、3-異丁基3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)均購自Sigama；胰島素(上海源葉生物科技有限公司)；四氮甲基偶氮唑鹽(MTT)及小鼠甘油三酯酶聯(lián)免疫試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司)；葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法，南京建成生物工程研究所)；PPARγ2和β-actin抗體(CST公司)；HRP標(biāo)記二抗(碧云天公司)；顯影發(fā)光液(新?；蚬?。

1.3 細(xì)胞處理

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇好的3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，在含10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM的完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，等細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2配制MDI 誘導(dǎo)劑母液 先配置母液，即將IBMX溶于DMSO配制濃度為0.05 mol/L，將地塞米松溶于無水乙醇中配制濃度為1 mmol/L，將25 mg 胰島素溶于25 mL pH3.0的稀HCl中，質(zhì)量濃度為1 g/L，3種母液配制完成，-20℃保存待用。

1.3.3細(xì)胞分組及誘導(dǎo)分化 誘導(dǎo)分化時(shí)，將以上3種母液溶于10% 胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)液中，終濃度為0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素，此為MDI誘導(dǎo)劑Ⅰ。再將胰島素母液混勻在完全培養(yǎng)液中配成終質(zhì)量濃度10 mg/L胰島素為誘導(dǎo)劑Ⅱ。待細(xì)胞生長至80%～90%、接觸抑制2 d 后開始誘導(dǎo)分化(第0天)并加入PC，將細(xì)胞分為對(duì)照組(只加完全培養(yǎng)液，不加誘導(dǎo)劑)、誘導(dǎo)分化組(加入MDI誘導(dǎo)劑)、 PC 0.5 g/L組(加入MDI和 0.5 g/L PC水提液)、PC 1.0 g/L組(加入MDI和1.0 g /L PC水提液)、PC 2.5 g/L組(加入MDI和2.5 g/L PC水提液)、PC 5.0 g/L組(加入MDI和5.0 g/L PC水提液)。加入MDI誘導(dǎo)劑Ⅰ培養(yǎng)48 h為第1次誘導(dǎo)，然后第2次誘導(dǎo)換誘導(dǎo)劑Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)48 h，接著第3次誘導(dǎo)換只含血清和雙抗的完全培養(yǎng)液，之后每48 h換液1次，共2次，每次換液時(shí)重新加入藥物，誘導(dǎo)分化第8天后分化完成。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1油紅O染色 細(xì)胞誘導(dǎo)分化完成后，先移去舊培養(yǎng)基，然后用PBS洗滌2～3次，4%多聚甲醛固定1 h，固定好后用PBS洗滌后控干，再用0.5%油紅O溶液染色1 h，之后用PBS洗滌2～3次，洗去多余浮色。在顯微鏡下觀察到分化成熟的脂肪細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞漿內(nèi)被染成紅色的環(huán)狀脂滴，并進(jìn)行照相。照相完畢，加入異丙醇于平板混勻器上搖勻5 min，吸出每孔液體，用ELISA酶標(biāo)儀檢測D492 nm值。

1.4.2甘油三酯(TG) 用ELISA試劑盒檢測。

1.4.3MTT法檢測PC對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 收集12,24,36,48 h細(xì)胞，每孔加入100 μL MTT溶液。孵育4 h，棄去舊液，每孔加入200 μL DMSO溶液，酶標(biāo)儀讀板，檢測D450 nm值，并計(jì)算相對(duì)增殖率和抑制率。相對(duì)增殖率=(試驗(yàn)組D值-空白孔D值)/(對(duì)照組D值-空白孔D值)×100%，抑制率=(1-試驗(yàn)組平均D值/對(duì)照組平均D值)×100%(同一時(shí)間)。

1.4.4Western blot法檢測3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化蛋白PPARγ2 通過向3T3-L1前脂肪細(xì)胞樣品中添加含有蛋白酶抑制劑的冷凍RIPA緩沖液來制備裂解物。漩渦震蕩數(shù)下混勻混合物，再放在冰上靜置裂解30 min，其中每過10 min震蕩混勻1次。然后將裂解樣品于4℃、14 000 r/min離心10 min，收集澄清的上清液并保存在-80℃。使用BCA試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)測得濃度將樣品濃度調(diào)至一致。在SDS聚丙烯酰胺凝膠(10%)上分離20 μg 的蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并在含有Tween-20(0.1%)和脫脂牛奶(5%的磷酸鹽緩沖液)封閉液中常溫封閉1 h。4℃環(huán)境下孵育一抗過夜，TBST洗滌液洗滌后室溫孵育二抗30 min，洗滌后使用Protein simpie system進(jìn)行顯影檢測，ImageJ軟件分析強(qiáng)度，以β-actin作為內(nèi)部對(duì)照。

1.4.5IR模型的建立 取分化成熟的脂肪細(xì)胞，于含0.2%BSA的培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再分為模型組和正常對(duì)照組，對(duì)照組給予常規(guī)高糖DMEM培養(yǎng)基，模型組給予1 mmol/L棕櫚酸(PA)作用48 h，之后換含有100 nmol/L的胰島素培養(yǎng)液刺激30 min 用于造模。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖消耗確定是否造模成功，造模成功的細(xì)胞用于后續(xù)糖脂代謝試驗(yàn)。

1.4.6葡萄糖過氧化酶法檢測葡萄糖消耗量 取誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組、IR模型組和模型組分別加入PC水提液(0.5，1.0，2.5，5.0 g/L)共6組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，完成后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用葡萄糖氧化酶法測定各組殘余的葡萄糖濃度，以未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度與之相減，計(jì)算出各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

2 結(jié)果

2.1 PC對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和抑制的影響MTT結(jié)果顯示，在添加不同質(zhì)量濃度PC水提液處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞12～48 h，隨著時(shí)間和質(zhì)量濃度的增加，PC對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率升高，呈一定的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。隨著PC質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的增殖率均明顯下降(P<0.05或P<0.01)(圖1)。加入不同質(zhì)量濃度的PC，隨著時(shí)間的延長，對(duì)3T3-L1前脂肪的抑制率也越高，且在36 h時(shí)抑制率達(dá)到最高，此時(shí)不同質(zhì)量濃度的PC抑制率分別是18%,28%,37%，47%(表1)。

表1 PC對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的抑制作用

*.與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；**.與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)圖1 PC水提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的相對(duì)增殖率的影響

2.2 細(xì)胞形態(tài)變化和PC水提液對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂肪含量的影響第8天誘導(dǎo)分化結(jié)束后，顯微鏡下可見對(duì)照組有少量細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞表型，有少量環(huán)狀脂滴形成。而誘導(dǎo)分化組可見細(xì)胞大都分化為典型的成熟脂肪細(xì)胞，細(xì)胞由梭狀的成纖維細(xì)胞變成圓圓的“戒狀”成熟脂肪細(xì)胞，脂滴明顯增多。與誘導(dǎo)分化組相比，PC組可見細(xì)胞脂滴數(shù)量較誘導(dǎo)分化組增加明顯，胞漿內(nèi)脂滴明顯增多，部分融合成較大脂滴；隨著PC質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞中出現(xiàn)的脂滴越多。油紅染色比色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度PC組脂滴極顯著增多(P<0.01)，與誘導(dǎo)分化組相比，5.0 g/L PC組脂滴顯著增多(P<0.05)(圖2)。

A.對(duì)照組；B.誘導(dǎo)分化組；C～F.分別為0.5,1.0,2.5，5.0 g/L PC水提物+誘導(dǎo)分化劑組。*.與誘導(dǎo)分化組相比差異顯著(P<0.05)；**.與誘導(dǎo)分化組相比差異極顯著(P<0.01)。#.與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；##.與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同圖2 PC水提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)變化和分化的影響(200×)

2.3 PC對(duì)成脂分化的促進(jìn)作用和分化相關(guān)蛋白PPARγ2表達(dá)水平的影響ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)分化組細(xì)胞TG含量增加，隨著PC質(zhì)量濃度增加，TG水平逐漸上升，尤其2.5，5.0 g/L PC組的TG含量顯著增加(P<0.05)(圖3)。Western blot結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，MDI誘導(dǎo)分化組PPARγ2蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；較MDI誘導(dǎo)分化組相比，不同質(zhì)量濃度的PC組PPARγ2蛋白表達(dá)水平有上升趨勢，1.0，2.5 g/L PC組極顯著升高(P<0.01)(圖4)。

圖3 3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量

圖4 PC水提物對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化蛋白PPARγ2表達(dá)的影響

2.4 IR建模結(jié)果完全分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞加入PA刺激48 h后，由表2可知，建模組的葡萄糖消耗量低于對(duì)照組，結(jié)果有極顯著性差異(P<0.01)。再加入100 μmol/L胰島素刺激細(xì)胞30 min，模型組的葡萄糖消耗量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，證明建模成功。

表2 3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的建立

2.5 葡萄糖消耗量藥物干預(yù)24 h后，與對(duì)照組相比，模型組葡萄糖消耗量低于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。加入PC的各組與模型組相比較，0.5，1.0，2.5，5.0 g/L的PC組有極顯著性差異(P<0.01)，提示PC水提液可顯著提高IR脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量(圖5)。

△△.與IR模型組相比差異極顯著(P<0.01)圖5 PC水提物對(duì)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量的影響

3 討論

脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞組成，除了具有脂肪儲(chǔ)存的作用，還作為最大的內(nèi)分泌器官，所產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞因子可以參與各種代謝，包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝[16]。而脂肪組織量不足會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸存儲(chǔ)不足，從而導(dǎo)致血漿游離脂肪酸水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉和肝臟中脂肪沉積增加，最終導(dǎo)致IR和T2DM，因此促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，增加脂質(zhì)積累也是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的途徑之一。傳統(tǒng)中藥作為我國治療疾病的重要方法，很多中藥提取物對(duì)于改善IR可能具有卓越的療效。

本研究采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討PC水提液對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化的影響，以及在IR狀態(tài)下對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用。研究表明，PC能夠明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，油紅染色結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞在不加誘導(dǎo)劑的情況下也能分化出少量脂滴，說明3T3-L1前脂肪細(xì)胞具有自分化的功能。而與誘導(dǎo)分化組相比PC水提液組能夠顯著促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的脂滴積累，ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量也顯示，與誘導(dǎo)分化組相比，添加2.5和5.0 g/L 的PC組能明顯增加細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積，表明促進(jìn)了3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，增加脂質(zhì)的形成。在奶牛畜牧業(yè)上，奶牛的能量代謝在過渡期往往面對(duì)著巨大挑戰(zhàn)，在分娩前后，奶牛能量缺乏，脂肪組織脂肪動(dòng)員，血漿胰島素和葡萄糖濃度降低，脂肪組織和其他周圍組織的胰島素敏感性受損以及兒茶酚胺、生長激素和糖皮質(zhì)激素的濃度增加，造成動(dòng)物機(jī)體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成減少，脂解作用增強(qiáng)[17]。故促進(jìn)脂質(zhì)生成表明PC水提液具有增強(qiáng)脂肪細(xì)胞胰島素敏感性和攝取葡萄糖的潛力。

脂肪細(xì)胞的分化還涉及一些重要轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化，包括過氧化物酶增殖物活化受體(PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein,C/EBP)家族[18]。而PPARγ被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)劑，參與控制能量平衡以及脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，PPARγ的激活可引起胰島素增敏并增強(qiáng)葡萄糖代謝[19-20]。PPARγ突變體可加劇IR并減小脂肪細(xì)胞大小[21]。PPARγ以2種同工型蛋白的形式存在，即PPARγ1和γ2，它們的N末端因啟動(dòng)子的替代使用而異[22]。其中PPARγ2是合成脂肪中重要的調(diào)控因子，PPARγ2基因的表達(dá)水平是作為反映脂肪細(xì)胞分化程度的重要標(biāo)志[23]。而本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用0.5，1.0，2.5，5.0 g/L PC水提液干預(yù)細(xì)胞后，與誘導(dǎo)分化組相比，PC組PPARγ2蛋白表達(dá)水平升高，尤其1.0，2.5 g/L PC組的PPARγ2蛋白表達(dá)極顯著上升(P<0.01)；表明PC水提液通過增加PPARγ2蛋白的表達(dá)水平促進(jìn)了3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化歷程。除了在脂肪形成中的關(guān)鍵作用外，PPARγ2還被認(rèn)為在維持成熟的脂肪細(xì)胞功能中起著重要作用，該功能控制著代謝關(guān)鍵酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[24]，因此PC水提液也可能是通過PPARγ2蛋白表達(dá)水平來改善IR狀態(tài)的。并且，奶牛泌乳期，胰島素敏感性受損會(huì)降低關(guān)鍵脂肪形成酶的轉(zhuǎn)錄和活性，限制脂肪細(xì)胞合成脂肪酸和甘油三酯的能力，從而增強(qiáng)脂肪組織釋放FFA的作用，進(jìn)一步造成體內(nèi)脂肪酸紊亂，發(fā)生奶牛酮病，加重奶牛能量負(fù)平衡狀態(tài)[25]，因此脂肪細(xì)胞甘油三酯的儲(chǔ)備是抵消圍產(chǎn)期奶牛能量負(fù)平衡的主要能源，故說明PC水提液促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)生成在減輕奶牛能量負(fù)平衡狀態(tài)上有潛在價(jià)值。

建立IR模型是體外篩選改善IR藥物的常用手段，可以在細(xì)胞及分子水平來研究IR的發(fā)生機(jī)制。本研究應(yīng)用1 mmol/L棕櫚酸為誘導(dǎo)劑建立IR模型，給予誘導(dǎo)劑后48 h，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞葡萄糖消耗明顯降低(P<0.01)，提示IR后細(xì)胞葡萄糖利用率降低。結(jié)果表明，添加不同質(zhì)量濃度PC水提液干預(yù)24 h后，0.5，1.0，2.5，5.0 g/L PC均能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的葡萄糖消耗(P<0.01)；表明PC具有改善IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞的IR狀態(tài)，提高了脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取和利用的能力，從體外細(xì)胞水平上說明PC具有改善IR的效果。

本研究結(jié)果表明，PC對(duì)改善IR有顯著作用，為中藥PC的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)，也為開發(fā)和有效利用PC在治療T2DM奠定了基礎(chǔ)。而IR的發(fā)生與奶牛酮病，能量負(fù)平衡的關(guān)系密不可分，故PC水提液對(duì)酮病的防治同樣具有重要意義，同時(shí)PC改善體外脂肪細(xì)胞IR的作用機(jī)制及PC對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率的影響及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。