異槲皮苷促進犬骨髓間充質干細胞(cBMSCs)的成骨分化及機理

汪婭媛，郭 娟，田仰清，嚴 涵，昂艷芬，閆曉霞，嚴玉霖*

(1.云南農業大學 動物醫學學院，云南 昆明 650201；2.云南西雙版納州動物疫病預防控制中心，云南 景洪 666100)

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新能力以及向骨和軟骨等多種中胚層組織分化的能力，在骨缺損的修復中起著關鍵作用[1]。BMSCs現已應用于多種人類與動物疾病模型的基礎研究中，并獲得了較好的效果[2]，以犬骨髓間充質干細胞(canine bone mesenchymal stem cells,cBMSCs)為基礎的再生醫學是獸醫學研究的熱點和前沿領域[3]。

天然類黃酮異槲皮苷，也稱為羅布麻甲素和槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[4],是我國云南特種經濟植物辣木中天然黃酮類的主要有效成分之一，具有抗骨質疏松、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗突變、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、神經保護等作用。近年來，研究人員利用中藥粗提物或其活性成分作用于BMSCs，探討中藥對BMSCs增殖、凋亡和分化的影響。有研究表明，中藥淫羊藿苷、柚皮苷等多種黃酮類化合物對BMSCs向成骨細胞分化有促進作用[5-6]。異槲皮苷可通過調控RUNT相關因子2和骨形態形成蛋白的表達來影響BMSCs的增殖與分化[7]，異槲皮苷與BMSCs的成骨分化有著密切的關系。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)參與細胞增殖和分化、形態維持、骨骼構建、凋亡、惡性轉化等的調節，在成骨細胞增殖、分化和應激中發揮重要作用[8]。目前的研究表明，JNK信號通路可能是細胞成骨分化相關信號通路之一，且許多中藥及化合物，如淫羊藿、川續斷皂苷Ⅵ、丙二醇等是通過JNK信號通路實現對BMSCs向成骨細胞分化的調控[9]。基于上述研究推測，異槲皮苷能促進cBMSCs的成骨分化，且分化機制可能與JNK信號通路有關，但目前相關研究較少，因此深入開展異槲皮苷對cBMSCs成骨分化影響的研究，可為進一步開展cBMSCs定向分化以及利用異槲皮苷防治相關疾病等的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器FITC標記的羊抗兔二抗(愛必信(上海)生物科技有限公司);RNA逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司);異槲皮苷標準品(四川省維克奇生物科技有限公司);倒置熒光顯微鏡(Olympus公司);BIO-RAD-CFX熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細胞的培養及分組取云南農業大學病理實驗室液氮保存的原代cBMSCs進行培養傳代，至第3代后用于后續試驗。通過MTT試驗計算得到異槲皮苷對cBMSCs的最適試驗濃度為10-6mol/L。試驗分為2組，對照組：即普通成骨誘導培養基(以DMEM培養基為基礎，添加地塞米松 0.25 μmol/L、抗壞血酸 5 mg/L、β-甘油磷酸二鈉水合物10 mmol/L、胎牛血清10% 和青鏈霉素 0.1%)；異槲皮苷組:即添加10-6mol/L 異槲皮苷的普通成骨誘導培養基。

1.3 MTT 法檢測細胞增值率MTT法參照GB/T16886.5-2003 《醫療器械生物學評價 5 部分：體外細胞毒性試驗》，在最適藥物濃度下測定對照組和異槲皮苷組的細胞活性，使用酶聯免疫檢測儀檢測各孔D490 nm值。

1.4 成骨誘導茜素紅染色cBMSCs傳代至第3代后接種六孔板，培養至 80% 后分別用普通誘導培養基和添加異槲皮苷的誘導培養基，分別培養 7,14,21 d 后去除培養基進行固定，洗滌后加入茜素紅染色，于相差倒置顯微鏡下觀察鈣化結節染色情況，染色完成后棄掉染液，拍照。

1.5 mRNA的提取與反轉錄收集細胞后，采用Trizol法提取總RNA。將完整性良好的RNA定量為 1 000 ng后進行反轉錄，按照寶生物反轉錄試劑盒說明書步驟操作。

1.6 實時熒光定量PCR根據NCBI數據庫中堿性磷酸酶(ALP)、特異AT序列結合蛋白2(SATB2)、SOS1和激活轉錄因子2(ATF2)的基因序列，利用在線Primer 6.0、Oligo 6.0等引物設計軟件設計熒光定量PCR引物，以GADPH為內參基因。利用反轉錄產物進行熒光定量PCR試驗。反應液體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward primer(10 μmol/L)0.8 μL，PCR Reverse primer(10 μmol/L)0.8 μL，DNA模板2 μL，滅菌水 6.4 μL。反應程序：5℃ 3 min；95℃ 1 min，50～60℃ 30 s，72℃ 5 min，擴增 40 個循環。

1.7 酶聯免疫分析細胞上清及細胞內ALP含量酶聯免疫分析細胞上清及細胞內ALP含量需在測定時制作標準曲線，按步驟將標準品進行處理，并設置空白孔，測定D值。以標準物濃度為橫坐標，D值為縱坐標繪制標準曲線。

1.8 統計學方法所有數據用平均數±標準差表示，應用SPSS 19.0 軟件，采用單因素方差分析及Tukey檢驗，P<0.05為差異顯著，使用Graphpad prism 6.0制作圖形。

2 結果

2.1 MTT檢測結果各組細胞增殖率見圖1，在所有時間點異槲皮苷組cBMSCs的增值率均顯著高于對照組(P<0.05)，說明異槲皮苷對cBMSCs無明顯細胞毒性，且異槲皮苷可促進cBMSCs的增殖。

注：與對照組比較，*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著。下同圖1 各組cBMSCs細胞增殖率(n=3)

2.2 茜素紅染色成骨誘導后細胞變為多角形或不規則狀，體積增大，鈣質沉積部分被茜素紅著色為紅褐色。誘導7 d時，用茜素紅染色，2組cBMSCs均未出現明顯的鈣化結節(圖2 A,D)；誘導14 d時，相較于對照組，異槲皮苷組有更多的紅褐色的鈣化結節(圖2 B,E)；誘導21 d時，異槲皮苷組的鈣化結節面積明顯增大(圖2 C,F)。

注：→指示為 cBMSCs 鈣質沉積圖2 成骨誘導茜素紅染色(400×)

2.3 成骨相關基因熒光定量 PCR 檢測結果

2.3.1cBMSCs中ALP mRNA的表達 從圖3可得知，異槲皮苷組ALP mRNA表達水平在培養7，14 d時極顯著高于對照組，而在培養21 d時則極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖3 cBMSCs ALP mRNA表達水平的比較(n=3)

2.3.2cBMSCs中SATB 2 mRNA的表達 從圖4可得知，相較于對照組，異槲皮苷組在所有時間點均可極顯著促進cBMACs中SATB2 mRNA的表達(P<0.01)。

圖4 cBMSCs SATB2 mRNA表達水平的比較(n=3)

2.4 細胞及上清中 ALP 含量檢測

2.4.1ALP的標準曲線 由ALP的標準品得到其標準曲線，回歸方程為y= 0.034 6x-0.012 1，相關系數為R2= 0.998 9，符合標準曲線要求(圖5)。

圖5 ALP的ELISA標準曲線

2.4.2ALP的含量變化 從圖6可得知，與對照組比較，異槲皮苷組cBMSCs在所有時間點ALP含量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖6 cBMSCs 培養基上清中 ALP 含量(n=3)

2.5 JNK信號通路相關基因熒光定量PCR檢測結果

2.5.1cBMSCs中SOS1 mRNA的表達 從圖7可得知，異槲皮苷組SOS1 mRNA表達水平在培養7 d顯著低于對照組(P<0.05)，培養14，21 d時極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖7 cBMSCs SOS1 mRNA表達水平的比較(n=3)

2.5.2cBMSCs中ATF2 mRNA的表達 從圖8可知，異槲皮苷組ATF2 mRNA表達水平在所有時間點均極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖8 cBMSCs ATF2 mRNA表達水平的比較(n=3)

3 討論

近年來中藥對成骨細胞成骨分化影響的研究逐漸增多，多種黃酮類的化合物被證實參與成骨細胞的鈣質沉積[10-12]。本研究在了解辣木的有效成分后，選擇將α-托可醌、異槲皮苷、綠原酯等辣木有效成分添加入cBMSCs培養基中，發現異槲皮苷對cBMSCs的活性影響顯著，最終選擇異槲皮苷進行進一步的研究。

3.1 異槲皮苷在cBMSCs成骨分化過程中促進細胞增殖經異槲皮苷培養1，2，5 d 后，MTT法檢測發現對照組在前期會出現少部分cBMSCs死亡的現象，其增殖率明顯低于添加異槲皮苷的cBMSCs。JNK信號通路磷酸化可介導細胞凋亡[13]，而本研究中的黃酮類化合物異槲皮苷可使SOS1 mRNA的表達量下降，對JNK信號通路上的相關因子有負調控作用，因此促進了cBMSCs的增殖，與齊鵬飛等[14]的研究結果相近。

在干細胞移植治療中，由于干細胞的特性，在其移植治療疾病過程中的異常增殖所導致的癌變也是再生醫學研究的一大難題。SOS1作為細胞癌變的指示因子之一，在癌癥發生時對細胞轉移、形態改變、黏附動力學等起重要作用，因此SOS1可指示在骨肉瘤中癌細胞的增殖擴散情況[15]。蔣國君等[16]報道，異槲皮苷通過MAPK信號轉導下調RAS、RAF、MEK、ERK mRNA及相關蛋白的表達，誘導肝癌細胞凋亡。JNK信號通路中的SOS1是組織癌變的指標之一，而本研究發現異槲皮苷可減少SOS1在cBMSCs中的表達水平，這提示異槲皮苷可能會降低cBMSCs移植治療時癌變的風險，但其中的機制以及作用需做進一步的研究。

3.2 異槲皮苷促進cBMSCs的成骨分化轉錄因子SATB2可以影響成骨細胞分化和頭骨發育，SATB2基因過表達可促進 MSC的成骨分化，當BMSCs向成骨細胞分化時，SATB2的表達量也會上調，其表達水平與成骨細胞分化程度呈正相關[17]，而ALP是BMSCs成骨分化程度的指示性因子[18]。本研究中異槲皮苷組相較于對照組明顯促進了cBMSCs的SATB 2和ALP的mRNA表達水平及ALP蛋白的表達，并使鈣質結節面積增加，表明異槲皮苷對cBMSCs的成骨分化有促進作用。多種黃酮類的化合物被證實具有促進成骨細胞鈣質沉積的作用，且有研究發現，絕經期婦女常發的骨質疏松癥，可通過食用與雌激素結構相似的異槲皮苷使病情得到改善[19]，上述觀點進一步證實異槲皮苷對成骨分化有促進作用。

3.3 異槲皮苷通過下調JNK信號通路促進cBMSCs成骨分化SOS1和ATF2是JNK信號通路的上下游因子。WANG等[20]發現，當JNK信號通路受阻時，SOS1的表達量會下降。且有研究表明通過實驗處理細胞，促使細胞SOS1的表達量上升后再抑制細胞 JNK 信號通路，SOS1的表達量會下降。ATF2是轉錄因子ATF/CREB家族的一員，細胞受到應激后通過MAPKs/p38/JNK磷酸化而被激活誘導細胞凋亡[21-22]。JNK介導ATF2磷酸化增強了其轉錄活性，c-Jun磷酸化的誘導對于許多細胞的增殖和凋亡非常重要[21]。本研究中，異槲皮苷組SOS1和ATF2 mRNA表達水平顯著降低，提示JNK信號通路受到抑制，而異槲皮苷促進cBMSCs成骨分化，這一過程可能是通過下調SOS1和ATF2從而抑制JNK信號通路實現的。有研究表明，JNK信號通路磷酸化有降低成骨細胞ALP沉積的作用，與異槲皮苷結構相近的化合物骨碎補可促進成骨細胞ALP的沉積，并下調JNK信號通路因子。本研究與劉立萍[23]的研究報道不一致，抑制JNK信號通路后，會顯著抑制中藥左歸丸對小鼠成骨細胞系MC3T3-E 1細胞的ALP活性。分析原因發現可能是由于所使用的細胞種類來源不同，cBMSCs相對于小鼠成骨細胞系是更為原始的細胞，而且藥物的處理濃度也不同，這有待于進一步研究。

綜上所述，異槲皮苷具有促進cBMSCs增殖及成骨分化的能力，這一過程可能是通過抑制JNK信號通路來實現的，且可能存在抑制細胞癌化的作用，提示異槲皮苷可能是一種在cBMSCs的研究和臨床治療中可考慮使用的細胞添加劑，但具體的添加劑量、作用時間及機制需要做進一步的研究。