RhD血型初檢陰性孕婦RHD基因分型及同種免疫研究*

馬玲 吳敏慧 趙芳 史麗莉

在已知的43個人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中，Rh血型系統(tǒng)最為復(fù)雜，且可以導(dǎo)致新生兒溶血病（hemolytic disease of fetal and newborn，HDFN）和溶血性輸血反應(yīng)，臨床意義僅次于ABO血型系統(tǒng)。其中RhD抗原免疫原性最強(qiáng)，相應(yīng)的抗D是導(dǎo)致嚴(yán)重HDFN的主要抗體[1]。臨床上對于RHD-HDNF的預(yù)防措施主要是定期進(jìn)行抗體篩查，同時及時給予抗D免疫球蛋白治療。中國人的RhD抗原變異型較多，根據(jù)抗原表達(dá)數(shù)量和性質(zhì)的差異，大致可分為弱D、部分D以及東南亞常見的Del型等。各種RhD變異型基因背景不一，機(jī)體免疫狀態(tài)及臨床風(fēng)險也不同。例如有觀點認(rèn)為，亞洲型DEL（分子遺傳背景為RHD基因exon9 c.1227G＞A同義突變）孕婦中，未發(fā)現(xiàn)抗D抗體產(chǎn)生，建議該型孕婦可以免去孕期頻繁地抗體篩查和抗D免疫球蛋白注射[2-3]。因此，明確各亞型臨床意義非常重要，對于孕婦RhD抗原變異型及母嬰間同種免疫開展研究，可以為RhD-HDFN的診斷、預(yù)防提供重要的實驗室指標(biāo)。

關(guān)于RhD陰性孕婦的同種免疫情況已有一些報導(dǎo)[4-6]，但是相關(guān)資料積累分析還遠(yuǎn)不夠，目前臨床對RhD陰性孕婦免疫血液學(xué)檢測及管理認(rèn)識有限，操作不統(tǒng)一[7]。本文對2018～2020年至本中心的RhD血型初檢陰性孕婦進(jìn)行RHD基因分型及同種免疫狀況分析研究，尤其關(guān)注亞洲型DEL的情況，為RHD-HDFN診斷及建立早期干預(yù)共識進(jìn)一步積累相關(guān)資料，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1 一般資料 2018年10月～2020年9月于本中心進(jìn)行產(chǎn)前檢查的孕婦108例，年齡21～41（中位數(shù)：29）歲；RhD血型初檢結(jié)果均為陰性，采外周靜脈EDTA抗凝血及不抗凝血各約3 mL；經(jīng)本人知情同意。

2 儀器與試劑 IgG/IgM型抗D試劑（分別為：Sanquin，荷蘭；Dominion，加拿大）；IgG型抗D試劑、IgM型抗C、抗c、抗E、抗e試劑、抗球蛋白試劑（IgG+C3d）、篩選細(xì)胞及譜細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，中國）；基因組DNA提取試劑盒（原平皓公司，中國）；2×Taq PCR Mix（博爾迪生物，中國）；人類紅細(xì)胞RHD基因分型試劑盒（PCR-SSP）（天津秀鵬生物技術(shù)，中國）；上述試劑均在有效期內(nèi)使用。Labofuge 400R低溫高速離心機(jī)（Heraeus Corp. 德國）；血型血清學(xué)專用離心機(jī)（久保田，日本）；ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析儀（NanoDrop Corp. 美國）；Alphalmager HP凝膠成像系統(tǒng)（Applied Biosystem，美國）。

3 方法

3.1 Rh表型鑒定：使用3種不同廠家IgG或IgM/IgG型抗D試劑，采用鹽水或間接抗人球試驗的方法進(jìn)行RhD陰性確認(rèn)。采用IgM型抗C、抗c、抗E、抗e試劑，分別進(jìn)行RhCcEe表型鑒定。

3.2 抗體篩查及鑒定：按照常規(guī)血清學(xué)方法，采用鹽水法及間接抗人球方法對患者血清進(jìn)行意外抗體篩選；對于抗體篩查陽性者進(jìn)行抗體鑒定試驗；同時采用倍比稀釋法進(jìn)行抗體效價測定，參考文獻(xiàn)[8]方法，以“1+”凝集的最高稀釋度管為滴定終點，記錄效價值。

3.3 DNA提取及RHD基因分型：離心吸取孕婦白膜層細(xì)胞，按照DNA提取試劑盒操作要求，提取基因組DNA。所有樣本采用商品化RHD陰性鑒定基因檢測試劑盒（PCR-SSP法）進(jìn)行RHD基因分型，根據(jù)說明書，該試劑盒可以有效地鑒定RHD*01N.01、RHD*01N.03、RHD*15、亞洲型DEL及RHD*06.03.01型。PCR反應(yīng)條件為： 96℃ 2 min，隨即96℃ 20 s，68℃ 60 s，5個循環(huán)；96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10個循環(huán)；96℃ 20 s，62℃ 50 s ，72℃ 45 s，15個循環(huán)；72℃，5 min，最后4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳（100 V，30 min），用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

3.4 RHD基因測序：對于血清學(xué)與基因分型結(jié)果有疑問的標(biāo)本，進(jìn)一步進(jìn)行測序分析。參考文獻(xiàn)方法[9]，對RHD基因10個外顯子進(jìn)行測序分析，測序引物同擴(kuò)增引物，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。 PCR總體積為20 μL，引物濃度為200 nM，PCR條件為：95℃，5 min；95℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35個循環(huán)后72℃，10 min；4℃。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限進(jìn)行測序。使用Sequencing Analysis 6和SeqScape v3.0軟件進(jìn)行測序圖譜分析和序列比對（參考序列：NG007494）。

結(jié) 果

1 Rh表型血清學(xué)結(jié)果 RhD血型初檢為陰性的108例樣本中，其中有6例RhD確認(rèn)試驗為陽性，102例為陰性。Rh分型結(jié)果共檢出ccee 61例、Ccee 37例、CCee 4例、ccEe 3例、CcEe 2例及ccEE 1例，見表1。

表1 RHD血清學(xué)及基因分型結(jié)果

2RHD基因分型結(jié)果 108例樣本中，存在不同的等位基因，參見表1。其中67例為RHD*01N.01，23例亞洲型DEL，10例RHD*01N.03型，2例RHD*06.03.01型，3例RHD*15。對于血清學(xué)與基因分型結(jié)果有疑問的3例標(biāo)本，進(jìn)行RHD基因10個外顯子測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一例RHD*05.03型，在exon5上存在c.667 T＞G 、c.676 G＞C 、c.697 G＞C 、c.712 G＞A突變 ；一例RHD*01N.25，在introne2最后一位堿基發(fā)生c.336-1G＞A突變；另發(fā)現(xiàn)一例新等位基因，在exon4上存在c.509 T＞G突變，見圖1。

圖1 一例c.509 T＞G突變測序圖

3 意外抗體篩查結(jié)果 108例樣本中，共計11例樣本檢出意外抗體，另有2例在注射抗D免疫球蛋白后，短期內(nèi)進(jìn)行抗體篩查，檢出低效價抗D ，未納入統(tǒng)計。參見表2。檢出的意外抗體均為Rh系統(tǒng)，其中10例為抗D，1例為抗D合并抗C；在多次檢測者中，隨著孕期增加，抗體由陰轉(zhuǎn)陽或效價有增高趨勢。11例個體中，其中9例為RHD*01N.01，1例為RHD*01N.03，1例為RHD*06.03.01。

表2 意外抗體篩查結(jié)果

討 論

中國漢族人群中RhD陰性表型比例較低，約0.4%左右[10]，加上初次妊娠產(chǎn)生抗D抗體幾率不大，因此對于RhD-HDFN預(yù)防、監(jiān)測和治療等并未引起足夠重視，常規(guī)抗D免疫球蛋白針劑也無法正常獲取，但是我國人口基數(shù)龐大，RhD陰性圍產(chǎn)婦絕對數(shù)量并不少，加之目前三胎政策的實施，增大了免疫幾率，因此，RhD母胎間同種免疫研究成為圍產(chǎn)學(xué)及輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不容忽視的問題。

本次研究采用商品化試劑盒（PCR-SSP法）進(jìn)行基因分型研究，在RhD血型初檢為陰性108例樣本中，發(fā)現(xiàn)存在不同的RHD等位基因，最常見的為RHD*01N.01（62.0%，67/108），其次為亞洲型DEL（21.3%，23/108）及RHD*01N.03型（9.3%，10/108）；另檢出2例RHD*06.03.01（1.9%，2/108）；3例RHD*15（2.8%，3/108）。結(jié)合血清學(xué)結(jié)果，剩余3例樣本可能含有其他或未知的等位基因，不適用該試劑盒，因此采用測序方法，檢出1例RHD*05.03型；1例RHD*01N.25型，在introne2最后一位堿基發(fā)生c.336-1G＞A突變，該突變位于剪切點位置，可能導(dǎo)致mRNA的正常拼接或拼接效率。另發(fā)現(xiàn)一例新的等位基因，在exon4上存在c.509 T＞G突變（Genbank：MW923730），該突變的意義有待進(jìn)一步研究。由于本研究未進(jìn)行RH盒子型分析，因此對上述基因分型結(jié)果，例如RHD*01N.03、RHD*06.03.01等，并不能明確是純合突變，還是雜合突變。

正常紅細(xì)胞表面RhD抗原數(shù)量約（1.0～3.3）×104個/紅細(xì)胞，而Del型低于200個/紅細(xì)胞[11]，常規(guī)血清學(xué)檢測不出，需要通過吸收放散技術(shù)才能檢測到。由于吸收放散方法略繁瑣，操作不當(dāng)易產(chǎn)生錯誤結(jié)果；且血清學(xué)方法不能明確分子機(jī)制，因此本次試驗中，直接采用基因檢測手段。本次發(fā)現(xiàn)的23例亞洲型DEL中，19例為Cc表型，4例為CC表型，均含有RhC抗原。在含有RhC抗原的全部44例個體中（37例Ccee，5例CCee，2 CcEe），52.3%（23/44）的RhC陽性者為亞洲型DEL，與之前報導(dǎo)類似[12-13]，進(jìn)一步提示RhC抗原可以作為亞洲型DEL的初判標(biāo)志。

本次研究中，有11例產(chǎn)生了Rh系統(tǒng)抗體，其中10例為抗D，1例為抗DC，未進(jìn)一步明確該抗體是否為聯(lián)合抗DC，即抗G。11例個體中，除1名妊娠史不明確外，其余均為多次妊娠者，此外2號曾有輸血史；在多次檢測者中，發(fā)現(xiàn)隨著孕期增加，抗體由陰轉(zhuǎn)陽或效價有增高趨勢，提示妊娠或輸血等免疫史與同種抗D的產(chǎn)生及效價高低呈正相關(guān)，RhD陰性孕婦應(yīng)盡可能避免多次免疫，以防止產(chǎn)生抗D抗體。

產(chǎn)生抗體的11例個體中，有9例為RHD*01N.01，1例為RHD*01N.03，1例為RHD*06.03.01。值得注意的是，23例亞洲型DEL，無一例產(chǎn)生抗D；其余幾種基因類型，是否會產(chǎn)生同種免疫性抗D，需增大樣本量進(jìn)一步觀察。郭偉等[14]在304名Rh陰性孕產(chǎn)婦中發(fā)現(xiàn)29例產(chǎn)生RhD抗體，無一例為亞洲D(zhuǎn)EL；Wang M等[15]在142名Del表型孕婦中，發(fā)現(xiàn)130例為亞洲型DEL，均未產(chǎn)生抗D；剩余的12例中，有6例產(chǎn)生抗體，其基因型為RHD與RHCE外顯子發(fā)生不同程度的重組交換。亞洲型DEL血型的基因背景為exon9 3' 端最后1位堿基發(fā)生c.1227G＞A同義突變，可能影響mRNA的正常拼接或拼接效率，導(dǎo)致RHD基因產(chǎn)物表達(dá)程度降低。因此，邵超鵬等[16]認(rèn)為，亞洲型DEL孕婦妊娠RhD陽性胎兒發(fā)生抗D同種免疫反應(yīng)的可能性很小，這部分個體可免去產(chǎn)前定期抗D篩查及預(yù)防性RhD免疫球蛋白的使用。本文的研究結(jié)果進(jìn)一步支持此觀點，該理論如果獲得推廣應(yīng)用無疑有良好的社會效益。

致謝感謝下列人員對本文血清學(xué)實驗提供的幫助：鄭凌，薛敏，劉太香，馮晨晨，邵雷，張若洋

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突