ABO*A3.07等位基因導致的A亞型鑒定一例

任小寧 房昆 鄭皆煒

資料與方法

1 一般資料

1.1 標本來源：患者男，漢族，45歲，無輸血史，2020年9月26日因休克就診于我院急診外科，血紅蛋白（Hb）114 g/L、血細胞比容（Hct）34.2%，申請備血。采集外周靜脈血各2 mL，EDTA抗凝待檢。

1.2 試劑與儀器：單克隆抗-A、抗-B標準血清、抗-A1、抗-H抗體試劑（上海血液生物醫藥有限公司，批號分別是20191018、20200522、20191121）、抗-AB抗體試劑（法國Diagast公司，批號837000），ABO標準紅細胞（上海血液生物醫藥有限公司，批號20205324），篩選細胞（上海血液生物醫藥有限公司，批號20207030），DG Gel ABOCDE卡（西班牙戴安娜公司，批號19025.01），奧森多雙人份血型卡（ORTHO公司，批號07880），基因組DNA提取試劑盒、第6和第7外顯子 ( Exon6和Exon7）直接測序引物（PAGE級）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成 ，克隆測序試劑，LA-Taq酶及載體（pMD18-T vector）（日本TaKaRa公司產品），所有試劑均在有效期內使用。凝膠微柱卡孵育器（西班牙DIANA公司）、全自動血型分析儀（ORTHO公司）貝索離心機和ABI3100基因測序儀（美國應用生物系統公司）等。

2 方法

2.1 紅細胞ABH抗原檢測：采用強生全自動血型分析儀及IgG抗人球單人份血型卡，檢測患者ABO抗原，后采用試管法復核：患者全血標本離心備用，取壓積紅細胞洗滌三次，室溫條件下使被檢者紅細胞分別與抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB和抗-H單抗反應, 鑒定其 ABH 抗原。

2.2 血漿ABO血型抗體及不規則抗體檢測：采用試管法，使血漿與標準A、B、O型紅細胞反應，檢測ABO血型抗體；采用微柱凝膠抗球蛋白試驗，使血漿與抗篩細胞反應，檢測不規則抗體。

2.3 DNA提取：按《DNA 提取試劑盒說明書》提取DNA，DNA定量分析后調整濃度為（20～30）ng/μL，A260/A280比率在1.6～1.9，4℃保存備用。

2.4 ABO基因Exon6、7直接測序

擴增引物分別為：

PCR擴增反應體系：dNTP 400 μmol/L，模板DNA 500 ng，引物0.1 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，Taq酶3 U，終反應體系為50 μL。

PCR擴增反應程序如下: 95℃預變性 10 min；94℃ 60 s，63℃ 90 s，72℃ 60 s，共10個循環；94℃ 60 s，61℃90 s，72℃ 60 s，25個循環；72℃延伸10 min，10℃保溫。擴增產物切膠純化后，進行正反雙向測序，測序引物同擴增引物，并在ABI3100-Avant上進行序列分析。（本部分試驗在上海市血液中心輸血研究所完成) 。

2.5 ABO基因克隆測序：采用LA-Taq酶對ABO基因Exon 6、7進行PCR擴增，將PCR產物純化后與pMD18-T載體連接，挑取多個陽性菌落進行序列測定，確定樣本的單倍型。

2.6 序列對比和分析：序列分析使用Chromas和Gentle軟件進行分析，參照人類紅細胞血型基因數據庫基因序列進行比對。

結 果

1 血型血清學結果 患者抗篩陰性，存在A抗原減弱；而患者紅細胞與抗-H凝集反應（4+）明顯強于正常B型細胞（3+），與抗-A和抗-AB反應鏡下觀察存在弱的混合凝集（凝集紅細胞＜10%），血清學表現推測為Aend亞型，需通過基因檢測進一步判斷。（患者血清學結果見表1）。

表1 患者血型血清學結果

2 ABO基因Exon6、7直接測序結果 ABO基因Exon6、7直接測序結果，外顯子6存在c.261delG，c.297A＞G堿基突變；外顯子7存在c.467C＞T 、c.646T＞A 、c.681G＞A、c.745C＞T、c.771C＞T和c.829G＞A突變，其中c.467C＞T、c.745C＞T突變為A3.07等位基因特征，c.261delG推斷可能為O.01.02等位基因。（見圖1）。

圖1 患者基因測序圖

3 ABO基因Exon6、7克隆測序結果 通過PCR產物的克隆測序，序列經對比發現存在兩種單倍型，一種為O.01.02，另外1條單倍型序列與A101標準序列對比，發現c.467C＞T和c.745C＞T突變。經檢索基因突變數據庫，可以判斷其含有A3.07和O.01.02等位基因。

討 論

ABO亞型是指紅細胞或分泌液（分泌到個體）所含A或B抗原量不同的表型[3]。ABO亞型在中國人群里的檢出率為0.015%[4]。它們大部分是經血型血清學試驗以抗原性弱為主要特征的多種表型，目前由國際輸血協會確認的A亞型基因型主要有A2、A3、Ax、Am、Ael、Aw，另外血清學的表現型還有Aint、Aend、Ay等表型[5]。在進行ABO血型鑒定時如果只做正定型,特別容易將亞型誤定為O型[6]。

ABO*A3.07等位基因導致的A亞型最早由中國臺灣LEI LI等人[7]報道，國內其他地區有相關報道[5，8-10]總結分析ABO*A3.07等位基因導致的A亞型可以表現出A3、Ax、Aend亞型的血清學特征，其中A3表型報道較多[5]。另據報道A3、B3亞型在中國人群ABO血型系統變異型中較為常見[11]。三者血清學特征中Ax血清中通常含有弱的抗-A1,紅細胞與抗A弱凝集，與抗AB凝集則較強；A3、Aend亞型最大特征是顯微鏡下呈現混合視野，區別在于前者有2+混合凝集較強，該患者多次離心后與抗-A和抗-AB反應鏡下觀察仍為弱的混合凝集（凝集紅細胞＜10%），推測其為Aend亞型。 出現這種結果原因可能與本實驗室采用的單克隆抗A的抗體效價不同或針對的細胞抗原表位不同有關，也有可能是由于A307血型個體差異的不同致紅細胞所表達A抗原量不同有關；并且由于缺乏人源試劑因此無法明確該患者血型具體的分型，只能推測其為Aend亞型。

對ABO亞型的準確鑒定，需根據紅細胞與抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H的凝集強度、血漿中是否存在抗-A1以及分泌型人的唾液中的A、B、H物質進行區分[12]。患者因病情未采集唾液，由于無法精準分型，需借助分子生物學的方法。通過對患者ABO基因的Exon6 、7進行直接基因測序和克隆測序分析，結果相互驗證，可以判斷其含有A3.07和O.01.02兩個等位基因，分子生物學的應用解決了血清學的局限性。

另外，亞型必須具有遺傳基礎，并且有明確的血清學特點。因年齡、疾病、妊娠等不可遺傳的因素造成的血型改變不能認為是亞型；而對于雖有基因改變,卻不影響血清學特點的ABO血型也不能稱為亞型[13]。該患者因非本地戶籍未做家系研究，但有文獻報道A3.07基因在和先證者父親、先證者以及先證者外甥女三代人中均有檢測到，說明該突變基因能夠穩定遺傳[14]。ABO血型抗原基因并不直接編碼ABH抗原，而是編碼產生特異性糖基轉移酶，并由它們分別將糖分子轉移至抗原表位的糖鏈上而合成 ABO 抗原。ABO糖基轉移酶分子鏈中一些氨基酸的不同，決定了其催化產生的糖分子抗原具有不同的特性和亞型。ABO亞型的形成機制常是在ABO基因的7個外顯子及部分內含子區域存在點突變、堿基缺失、替代、插入等造成核苷酸序列的改變[15-16]。ABO*A3.07等位基因中c.745C＞T突變致使第249位氨基酸精氨酸置換為色氨酸（p.Arg259Trp），可能是導致A型糖基轉移酶活性降低的主要原因[17]。

ABO血型系統是與臨床安全輸血關系最為密切的血型，血型鑒定時一定要同時做正、反定型, 可避免亞型的漏檢或誤判。另外，由于試劑抗體的克隆株不同、實驗人員的操作及主觀性，在亞型判別上存在差異，同時亞型的基因遺傳背景復雜，分子也可能存在異質性[16]。總之一種基因型可對應多種表型[18]。因此，對于懷疑是ABO亞型的患者基因檢測是獲得亞型的最直接證據，但基因分型預測的血型表型最終還需應用血清學方法進行驗證，并對有意愿患者開展家系調查，提供輸血安全保障。

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