1例Rhmod個體的RHAG基因分析

黃嫻 李立新 李雙玉 吳麗娜 解金輝

Rh血型系統（ISBT004）包含RHD和RHCE兩個同源連鎖基因，分別編碼D抗原和CcEe抗原，是最重要的紅細胞血型系統之一。RHAG血型系統（ISBT030）由RHAG基因編碼Rh相關蛋白RhAG，RhAG蛋白對RhD/CE抗原在紅細胞膜上的正確連接定位十分重要[1]。RHAG基因變異可導致Rh血型抗原顯著減少，稱為Rhmod[2]。我們通過1例由于RHAG新復合雜合突變導致的Rhmod家系進行血清學與基因檢測，并采用生物信息學方法和蛋白結構模型，初步探討這例新的復合突變導致Rhmod型的分子基礎。

材料與方法

1 研究對象 Rhmod型家系來自天津，先證者父親已故，無兄弟姐妹子女，直系親屬僅現存母親。先證者，女，18歲，無輸血史和妊娠史，因溶血性黃疸收住入院，總膽紅素51 μmol/L，間接膽紅素27 μmol/L，血紅蛋白93 g/L。醫院初檢為Rh陰性，送檢血液中心進行交叉配血，為切脾手術備血。

2 試劑與儀器 抗C、c、E、e（CE-IMMUNODIAGN OSTIKA公司），抗D試劑4種（上海血液生物，加拿大宜美康，CE-IMMUNODIAGNOSTIKA，Sanquin），DNA提取試劑盒（Magen公司），Taq DNA聚合酶（Takara公司）。微柱凝膠抗球蛋白檢測卡、孵育器、卡式離心機（BIO-RAD公司），離心機（KUBOTA公司），分光光度計（IMPLEN公司），PCR儀（ABI公司），電泳儀（Thermo公司），凝膠成像儀（北京東訊天地）。所有試劑與儀器均在有效期內使用。

3 方法

3.1 Rh抗原檢測：采用試管鹽水法、微柱凝膠卡法，使用4種克隆株的抗D試劑檢測先證者RhD抗原。用吸收放散試驗檢測其紅細胞是否表達微量的D抗原，放散法使用Sanquin公司的酸放散試劑盒。由于樣本量所限，未進行RhCE抗原的吸收放散試驗。采用試管鹽水法和微柱凝膠卡法檢測所有受試者的RhCE抗原、不規則抗體篩查和直抗。

3.2 DNA提取及PCR擴增：采用蛋白酶K法抽提所有受試者的外周靜脈血DNA，檢測抽提DNA的濃度和純度。自行設計RHD、RHCE、RHAG基因所有外顯子的PCR引物（由Invitrogen公司合成），尋最適條件進行PCR-SSP。

3.3 DNA測序分析：RHD、RHCE、RHAG的PCR擴增產物送Invitrogen公司測序，測序引物使用擴增引物。測序結果用Choromas軟件與ISBT公布的RHD（NG_007494）、RhCE（RhCE*ce，NM_020485）、RHAG（NG_011704）基因序列進行比對。先證者母親進行相同的PCR擴增和RHAG基因測序。

3.4 生物信息學分析：使用PolyPhen-2和Provean兩個在線生物信息學軟件，分析氨基酸變異對蛋白質功能的影響。運用PyMOL軟件，對變異氨基酸進行空間定位，并分析其與周圍氨基酸的氫鍵作用。

結 果

1 血清學檢測結果 先證者D、C、c、E、e抗原鹽水法、微柱凝膠卡法均為陰性，分析可能為Rh抗原系統抗原不表達（Rhnull表型）或弱表達（Rhmod表型）。吸收放散試驗顯示D抗原為陽性，先證者符合Rhmod表型。其母親Rh抗原未見明顯異常，Rh血型為ccDEE。先證者和母親抗篩、直抗均陰性。

2RHD和RHCE基因變異檢測結果 先證者RHD基因1-10外顯子及剪切點區域未發現突變，RHCE*01.01第1外顯子存在48G＞C（Trp16Cys），是常見的RHCE等位基因。

3RHAG基因變異檢測結果 如圖1所示，先證者RHAG基因第3外顯子編碼第142位氨基酸的堿基發生c.425T＞C，使亮氨酸轉為脯氨酸（p.Leu142Pro），第8外顯子編碼第376位氨基酸的堿基發生c.1126G＞A，使甘氨酸轉為蘇氨酸（p.Gly376Ser），兩處變異均為雜合錯義突變。先證者母親RHAG基因第8外顯子也存在c.1126G＞A。

圖1 先證者RHAG基因測序結果

4 生物信息學分析結果

4.1 蛋白影響力評估：如圖2所示，p.Leu142Pro變異PolyPhen-2評分結果為0.999分，Provean評分結果為-6.220分；p.Gly376Ser變異PolyPhen-2評分結果為1.000分，Provean評分結果為-5.580分，預示這兩處變異均為有害變異，可影響蛋白質功能。

圖2 2種生物信息學軟件對氨基酸變異預測結果

4.2 變異位點空間結構分析結果：PyMOL模型分析顯示，RhAG蛋白有12個α-螺旋，p.Leu142Pro位于第5個α-螺旋跨膜區域接近胞內處，p.Gly376Ser位于第12個α-螺旋跨膜區域，如圖3所示。圖4為氨基酸變異前后氫鍵的比較，p.Leu142變為p.Pro142后，與p.Pro138的氫鍵作用消失；p.Gly376變為p.Ser376后，增加p.Ala372、p.Val373、p.Leu377位之間的3個氫鍵。分析顯示2處變異均可能改變氨基酸間氫鍵的聯系。

圖3 RhAG蛋白三維空間結構模型

圖4 氨基酸變異前后氫鍵比較

討 論

RHAG基因位于6號染色體長臂6p11-p21. 1，它編碼的RhAG抗原蛋白含409個氨基酸，12次穿膜，N端和C端都在膜內[3]。RhAG蛋白是膜上多聚體的主要成分之一，與RhD、RhCE、GPB、GPA、CD47、LW、帶3蛋白和帶4.2蛋白組成蛋白復合物[4]。如果RhAG抗原不能正常表達，不僅造成RhD/CE蛋白不能正常穿膜，還會造成紅細胞塌陷，口形和球形紅細胞增多[5]，細胞水分過多和陽離子外流[6]，紅細胞在體內存活期縮短，個體易發生輕到中度的代償性溶血性貧血[7-8]，少數重度病例在脾切除術后仍有溶血癥狀[9]。本文中先證者患有溶血性黃疸，可能與RHAG基因變異有關，脾切除手術未輸血，術后溶血和貧血癥狀減輕。

Rh缺失型可分為無效等位基因型（amorph type）及調節型（regulator type）。Rhmod屬于調節型，RHD/CE基因正常，但RHAG是無活性的突變純合子或雙雜合子[10]。本文中先證者的RHAG基因外顯子存在425T＞C和1126G＞A兩處變異，均為雜合錯義突變，導致Rh抗原表達顯著減少的Rhmod型。Rhmod型案例罕見，目前國際上報道的Rhmod型有RHAG1183delA、RHAG3G＞T、236G＞A[11]、 398T＞C、572G＞A[12]和707A＞C等，比對國內外文獻和NCBI、ISBT數據庫網站，未發現本文中RHAG兩處位點變異的報道，為新的基因變異。

先證者的兩處變異，1126G＞A遺傳自母親，先證者父親已故無法測序且無兄弟姐妹子女，推測425T＞C可能遺傳自父親。而先證者母親Rh抗原未見明顯異常，母親應為攜有一條正常RHAG基因，一條變異基因。進一步試驗可檢測先證者及母親RhAG及其它相關蛋白的表達水平，還可構建突變細胞體外分析變異對蛋白表達的影響。本文三維模型顯示先證者1處變異氨基酸位于α-螺旋跨膜區域接近胞內區，2處變異均可能改變氨基酸分子間作用，蛋白功能預測軟件預測為有害，推測其可能影響其與RhD/CE蛋白在胞內結合形成多聚體而不利于RhD/CE蛋白跨膜，為探索Rhmod的分子機制提供啟示。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突