云南地區育齡人群血小板抗原基因多態性初步研究*

羅梓瑜 董偉群

自2016年，國家全面開放“二孩”以來，人們的生育意愿得到了政策支持。今年“三孩”生育政策逐步落地，隨著新生人口的激增，圍產期母嬰安全又提到了新的高度。反復多次的妊娠可能會導致母體產生針對胎兒血小板抗原的抗體，并由此引發不良妊娠、胎兒及新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia,FNAIT）等疾病。

隨著對不良妊娠以及FNAIT病理生理的研究發現，人類血小板抗原（HPA）經同種免疫所產生的血小板特異性抗體是造成不良妊娠以及FNAIT的重要原因。既往的研究顯示不同人種、地區以及民族間的HPA基因頻率具有差異，因此了解本地區HPA基因分布頻率、分布特點，對降低相關疾病的發病率具有重要意義。本文針對研究顯示與不良妊娠和FNAIT相關的HPA1-5系統的基因型在云南地區的分布情況進行檢測分析。

資料與方法

1 研究對象 a：2020年1月1日～2021年7月31日間收集576名健康志愿者進行血小板HPA1-5基因分型。因云南地處少數民族聚集地區，故捐獻者中包括漢族150例、景頗族148例、阿昌族139例、傣族139例，所有研究對象間三代內無血緣關系，無外族通婚情況，并獲院倫理委員會審批履行知情告知；b：為了解地區內育齡女性血小板抗體陽性率，對同期來我院就診的產科和生殖遺傳科患者中，隨機選擇630例進行血小板抗體檢測與抗體鑒定，并通過電子病歷系統查詢患者一般臨床資料，研究對象除妊娠或生殖系統疾病以外無其他合并疾病。

2 樣本采集 每人抽取EDTA-K2抗凝靜脈血3 mL，于-80℃保存待檢，用于血小板抗原基因分型；血小板抗體篩查以及血小板抗體鑒定標本為EDTA-K2抗凝靜脈血，分離血漿后，按預定檢測時間分別保存在＜-18℃或-80℃。

3 儀器與試劑 PCR擴增儀、水平電泳儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統：Bio-Rad公司Gel Doc EQ凝膠成像系統；血小板抗原基因分型試劑盒（長春博德生物技術有限公司）；血小板抗體檢測試劑盒（荷蘭Sanquin），MASPAT指示紅細胞（荷蘭Sanquin），MASPAT血小板懸液（荷蘭Sanquin），PBS溶液（上海博古生物）血小板抗體鑒定試劑盒PAKPLUS微孔板試劑盒（美國GTI公司），恒溫酶標儀(TECAN)，磷酸氯喹溶液。

4 DNA提取 利用碘化鉀法，紫外分光光度計測定提取的基因組DNA的紫外吸收峰，在波長260 nm、280 nm分別測定吸光度，計算DNA濃度與純度。稀釋成1 μg/μL-20℃儲存。

5 HPA基因分型 包括PCR引物混合物（序列特異性引物0.4 μmol/L，內參引物0.4 μmol/L）、10×PCR Buffer5 μL、dNTP0.2 mmol/L，Taq酶0.75 U和基因組DNA 1μg，在同一條件下對HPA1-5系統同時進行擴增。反應條件：94℃、9 min；94℃、1 min；61℃、1 min；72℃、1 min；共35個cycle；最后72℃，10 min。

6 檢測擴增產物 PCR產物10 μL在2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）中電泳，電壓80 mV，電泳時間30 min，自動凝膠成像系統觀察并記錄結果。

7 血小板抗體篩查 待檢血漿加入反應孔中孵育，若血漿中含有血小板抗體，則該抗體與反應孔中的血小板結合，未結合的成分通過洗滌被去除，加入抗人-IgG指示紅細胞，指示紅細胞平鋪在反應孔底部為陽性反應，指示紅細胞在離心力的作用下聚集于反應孔的底部中央為陰性反應。

8 血小板相關抗體鑒定 HPA抗體檢測試劑盒包被了血小板特異性抗體（抗-HPA）和組織相容性抗體（抗-HLA-Ⅰ），其中血小板特異性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa孔包被的抗原有HPA-1a/1a、HPA-3a/3a、HPA-4a/4a；HPA-1b/1b、HPA-3b/3b、HPA-4a/4a。GPⅠa/Ⅱa孔分別包被了HPA-5b/5b和HPA-5a/5a；按試劑盒說明書操作，酶標儀在405 nm讀取吸光度，測定孔吸光度大于等于陰性孔讀數的2倍即為陽性。

9 統計學處理 采用SPSS22統計軟件，進行χ2檢驗，不同人群間基因頻率的比較進行χ2檢驗(精確概率法)，基因型之間的比較采用χ2檢驗的多個構成比的比較。P＜0.05為具有統計學差異Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，求得觀察值與期望值間的P值，以P＞0.05為符合平衡法則。各系統對偶抗原不配合概率（血小板隨機輸注HPA錯配概率）用此公式計算MMP=a2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab（1-ab）［12］，a、b為對偶抗原等位基因頻率。

表1 阿昌族組HPA 1-5系統等位基因和基因型頻率分布（n=139）

表2 景頗族組HPA 1-5系統基因和基因型頻率分布（n=148）

表3 傣族組HPA 1-5系統基因和基因型頻率分布（n=139）

表4 漢族組HPA 1-5系統基因和基因型頻率分布（n=150）

結 果

1 云南各民族HPA基因型和等位基因頻率分布 5個HPA系統中，景頗族HPA-4基因型均為aa，未檢測到b等位基因；其余民族及其他HPA系統同時檢測到a和b等位基因，除HPA-3系統外均以aa基因型為主。

2 云南地區各民族間基因頻率比較 見表5。

表5 不同民族間基因頻率的比較

不同民族間HPA基因頻率的組間比較，阿昌族組HPA-1a基因頻率與其他民族相比，差異有統計學意義（P＜0.05)；景頗族組的HPA-2a系統的基因頻率與其他組的差異具有統計學意義（P＜0.05)；其余各組間基因頻率的差異無統計學意義。

3 云南地區孕婦血小板抗體篩查情況 檢測結果顯示，630例患者血小板抗體檢測陽性的有90例，陽性患者民族均為漢族，陽性率為14.29%，其抗體分布頻率見表6。對58例HPA抗體陽性患者進行HPA抗體分類（包括單獨抗-HPA抗體和抗-HLA抗體合并抗-HPA抗體陽性患者），結果見表7。

表6 90例血小板抗體陽性患者抗體分布頻率

表7 58例HPA抗體分類

討 論

孕婦產生的同種免疫性血小板抗體進入胎兒體內致敏胎兒血小板后，使致敏血小板在網狀內皮系統被巨噬細胞吞噬，從而導致患兒血小板減少，是典型FNAIT的病理機制。FNAIT的發生與HPA多態性有關，產生的HPA抗體是引起FANIT的主要原因，FNAIT的主要風險是顱內出血（intracranial hemorrhage，ICH），而ICH的主要原因可能是來自母體的同種免疫性血小板抗體使患兒血管生成受損而不是血小板減少[1]。已報道引起FNAIT的抗體有抗-HPA-1a、抗-HPA-1b、抗-HPA-5a、抗-HPA-5b、抗-HPA-4b、抗-HPA-3a、抗-HPA-2a和抗-CD36等[9-11]。HPA基因分布在不同種族、不同民族、同一民族的不同人群中甚至都可能不同，其中具有臨床意義的抗原也不同。

本研究對云南地區不同民族的HPA 1-5系統進行基因分型，結果顯示，除景頗族HPA-4基因型均為aa，未檢測到b等位基因外，其余基因座位均符合Hardy-Weinberg平衡。在我們所檢測的5個系統中，其中對偶抗原不配合概率最高的系統為HPA-3系統，這與先前其他地區的研究數據一致，猜測抗-HPA-3a抗體所導致的FNAIT和流產，是本地區需要重點關注的對象。在歐美地區絕大多數FNAIT由HPA-1系統的抗-HPA-1a引起[3-4]，該系統阿昌族組基因頻率與其他組相比存在差異，猜測云南地區阿昌族產生致病抗體的可能性高于其他民族。景頗族組的HPA-2系統的基因頻率與其他組的差異具有統計學意義，地區內景頗族患抗-HPA-2a抗體引起的典型及非典型[2]的FNAIT的風險可能高于其他民族。同屬于亞洲人群的日本，引起FNAIT最常見的抗體是抗-HPA-5b，其次為抗-HPA-4b[4-5]。在我們的研究中，景頗族組HPA-4系統未檢測到b等位基因，所以在景頗族中產生抗-HPA-4b抗體的可能性相對較低。對于HPA-5系統的研究顯示，漢族組MP顯著低于其他民族組，對地區內不同民族的致病性抗體研究具有重要意義。

本地區育齡婦女血小板抗體陽性率為14.29%，高于國內相關報道（8.1%）[6]。分析原因可能為納入研究的病例有部分生殖遺傳科病人，本身就存在有不良孕產史或者多次妊娠的情況，故血小板抗體陽性率稍高，也進一步提示血小板抗體檢測對研究反復流產病因、早期預測及預防FNAIT的發生有重要作用。且存在一部分HPA抗體和HLA抗體共同存在的情況，抗-HPA抗體不論是單獨存在還是和抗-HLA抗體一起檢出都具有臨床意義[13]。在HPA抗體的分類中發現，GPⅡb/Ⅲa孔陽性率較高，陽性孔表達抗原為HPA-1a/1a、3a/3a、4a/4a；HPA-1b/1b、HPA-3b/3b、HPA-4a/4a，雖因客觀條件限制未能對所有的HPA抗體陽性的病人進行基因分型，但根據云南漢族人群HPA1-5系統的基因多態性分析，HPA-3是雜合度最高的系統，推測這部分陽性病例的HPA抗體類型很有可能為抗-HPA-3系統的抗體。雖然漢族組的HPA-5系統MP值低于其他民族組，但GPⅠa/Ⅱa孔陽性占到一定比例，提示出現抗-HPA-5系統的致病性抗體，雖然從基因頻率分析，漢族出現抗-HPA-5系統抗體的概率低于其他組，但在多民族聚集地區不同民族間的通婚現象對基因多態性有一定影響，在研究血小板抗體對反復流產及FNAIT的影響時需對患者的一般資料進行詳盡的分析。

在血小板鑒定的后續研究中，因條件限制未能對血小板抗體的特異性進行更近一步的鑒定，僅能利用現有的數據進行推測，抗體的特異性和HPA基因頻率的關系有待更深入的研究，以及對地區內其他民族的HPA基因多態性的研究還有很大的空白，是本研究的不足之處。

對分娩過FNAIT患兒或有過不明原因自然流產史的孕婦進行血小板相關抗體篩查，可以預測FNAIT的風險。母體循環血液中檢出靶向胎兒（或新生兒）血小板抗原的抗體是診斷FNAIT的重要依據[3]，FNAIT患兒血液中也可能檢出與其母親血液中相同的特異性靶向患兒血小板抗原的抗體。FNAIT患兒母親再次妊娠時發生FNAIT的概率取決于生物學父親攜帶的與胎兒母親血小板抗體靶向抗原的基因型。如胎兒生物學父親攜帶的抗原基因為純合子，FNAIT的發生率接近 100%，如胎兒生物學父親攜帶的抗原基因為雜合子，則FNAIT的發生率為50%[8]。

血小板特異性抗原所產生的血小板特異性抗體，是造成孕早期流產，胎兒出生后罹患FNAIT的重要原因。由于HPA具有遺傳多態性，不同地區引起FNAIT的主要HPA類型也有差異。了解不同地區HPA基因頻率的差異，不僅有助于預測該地區人群患FNAIT的風險，并且可以為建立血小板供者HPA資料庫奠定基礎。

云南地處少數民族聚集地區，不同民族間有通婚現象，因此對HPA基因多態性的研究，更有助于闡明引起本地區人群引起不良妊娠以及FNAIT等疾病的主要HPA抗體，協助疾病的預防、診斷及治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突