3個HLA-A新等位基因的序列分析及確認*

尚利俠 齊珺 武君華 陳樂 王滿妮 王小芳 房婕 王天菊

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）是目前所知人體最復雜、最具多態性的基因遺傳系統，位于第6號染色體短臂，具有高度的遺傳多態性，在同種異體組織器官移植及移植物的急性排斥反應中起重要作用。近年來，隨著DNA測序技術的快速發展，新的等位基因不斷被發現。我們在對2018年中國造血干細胞捐獻者資料庫陜西分庫入庫樣本進行A/B/C/DRB1/DQB1位點常規檢測時，發現3個樣本HLA-A位點疑似新等位基因，對這3個樣本采用基于ION S5TM平臺的下一代測序技術（Next Generation sequencing, NGS）進行鑒定，經向世界衛生組織提交相關信息后，于2019年3月30日被WHO HLA因子命名委員會分別正式命名為HLA-A*02:897、HLAA*02:898、HLA-A*02:899。

材料與方法

1 標本來源 2018年中華骨髓庫陜西分庫造血干細胞志愿捐獻者。先證者一為陜西籍、漢族、女性、32歲；先證者二為陜西籍、漢族、女性、19歲；先證者三為青海籍、蒙古族、女性、20歲。

2 主要試劑和儀器

2.1 主要試劑：北京天根血液基因組DNA提取試劑盒（批號：R7229北京TIANGEN）；SeCore?HLASBT分型試劑（批號：006、007、005、005、006美國One Lambda 公司）；NXTypeTMNGS測序試劑（批號：LOT 002 美國One Lambda 公司）。

2.2 主要儀器：生物安全柜（型號BC-1000ⅡA，蘇州安泰空氣技術有限公司）；核酸檢測儀（型號Gene Quant pro，Biochrom公司）；PCR擴增儀（型號SENSO QUEST，圣歐國際有限公司）；DNA測序分析儀（型號3730xl，美國ABI公司）；ION S5TM測序儀（美國One Lambda 公司）。

3 方法

3.1 標本采集和基因組DNA的提取：采集志愿捐獻者外周靜脈血5 mL（EDTA抗凝），采用北京天根血液基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明提取DNA，應用Gene Quant核酸蛋白檢測儀測定濃度和純度。

3.2 PCR-SBT（Sanger測序）：嚴格按照SeCore?HLA-SBT分型試劑盒說明書對提取的DNA進行測序分析。參照王天菊等[1-2]提及的方法。電泳序列導入uTYPE?（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）分析軟件進行分析后發現，樣本1相對于HLAA*02:01，02:07:01，第3外顯子520位有一個堿基差異；樣本2相對于HLA-A*02:06，33:03，在第4外顯子641位有一個堿基差異；樣本3相對于HLAA*02:01:01，02:01:01，第4外顯子652位有一個堿基差異。

3.3 PCR-SBT（Sanger測序）：進一步采用NGS方法對3個樣本進行分析，以確認堿基變異以及變異的具體位置。二代測序主要分為文庫制備，模板制備，測序反應和數據分析三大步驟。① 文庫制備：測定DNA濃度后均一化，采用Thermo Fisher Scientific的NXTypeTM NGS試劑擴增。擴增產物濃度均一化，將處理好的產物片段化，接頭連接，末端修復，加標簽，磁珠純化選擇目標片段。二次擴增，純化和定量后，將產物進行等摩爾混合。② 模板制備：制備好的文庫進行單克隆擴增。③ 測序反應和數據分析：將擴增產物加載至芯片上，在Ion S5測序平臺上加入4種脫氧核苷酸，開始測序反應，采用Type Stream Visual軟件指定HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1等位點基因型。

結 果

1 PCR-SBT（Sange測序）分型結果 將序列導入uTYPE?分析軟件發現，3例樣本A位點首次直接測序結果與目前所有已知A位點等位基因序列均不完全一致。樣本1相對于其同源性最高的雜合序列HLAA*02:01，02:07:01，第3外顯子區域520位有一個堿基變異（見圖1A）；樣本2相對于其同源性最高的雜合序列HLA-A*02:06，33:03在第4外顯子區域641位有一個堿基變異（見圖1B）；樣本3相對于其同源性最高的等位基因組合HLA-A*02:01:01，02:01:01，第4外顯子區域652位有一個堿基變異（見圖1C），經二次復核，3例樣本A位點測序結果均與第一次相同。為了明確變異堿基位于哪個等位基因，進一步用NGS方法進行分析。

圖1A 樣本1 HLA-A位點測序結果；圖1B 樣本2 A位點測序結果；圖1C 樣本3 A位點測序結果

2 NGS結果 NGS對HLA I類位點全長進行測序，發現3例樣本均攜帶1個HLA-A新等位基因。樣本1與同源性最高的A* 02:07:01:01相比，在第3外顯子520位置發生了G＞A堿基變異，導致第174密碼子由GCC＞ACC，氨基酸由丙氨酸變為蘇氨酸（Ala＞Thr）；樣本2與同源性最高的A*02:06:01:01相比，在第4外顯子641置位發生C＞T堿基變異，導致第214密碼子由ACT＞ATT，氨基酸由蘇氨酸變成異亮氨酸（Thr＞Ile）；樣本3與同源性最高的A*02:01:01:01相比，在第4外顯子652位置發生了G＞C堿基變異，導致第218位密碼子由GTC＞CTC，氨基酸由纈氨酸變成亮氨酸（Val＞Leu）。新等位基因與其同源性最高的等位基因部分核苷酸比對見圖2。

圖2 未知等位基因與同源等位基因部分核苷酸比對，差異核苷酸位置如箭頭所示

3 新等位基因確認及命名 將3例樣本的NGS單鏈序列提交給Genbank，得到的Bankit ID及相關數據上報給WHO HLA因子命名委員，于2019年9月30日被WHO HLA因子命名委員會分別正式命名為HLA-A*02:897（HWS10056319）、HLAA*02:898（HWS10056321）、HLA-A*02:899（HWS10053323）。

4 3例樣本HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位點高分辨確認分型結果 經SBT（Sanger測序）分型和NGS二次確認，3例樣本基因型如表1。

表1 3例樣本高分辨分型結果

討 論

HLA-A是HLA-I類基因，編碼的蛋白質產物以糖蛋白的形式幾乎表達在所有有核細胞表面。HLA-I類分子的重鏈（α鏈）胞外段有三個結構域（α1、α2、α3），其中α1、α2兩個結構域共同組成抗原結合槽，α3及β2-m屬于免疫球蛋白超家族結構（IgSF）域。已經證實HLA-I類基因的第2、3、4外顯子分別編碼α鏈的α1、α2、α3結構域，本次實驗中確認的新等位基因A*02:897與A*02:07:01相比，在第3外顯子520位發生G＞A堿基變異，導致第174位氨基酸由丙氨酸（AIa）變為蘇氨酸（Thr）,α2結構域氨基酸的改變可能會影響抗原結合的特異性以及TCR識別作用，從而引起不同的免疫應答；A*02:898與A*02:06:01相比，在第4外顯子641位發生了1個堿基變異，導致第214位氨基酸由蘇氨酸（Thr）變為異亮氨酸（Ile）；A*02:899與A*02:01:01相比，在第4外顯子652位發生了1個堿基變異，導致第218位氨基酸由纈氨酸（Val）變為亮氨酸（Leu）而這兩個變異均位于α3結構域，推測該變異更多的影響HLA分子的穩定性，是否會引起HLA分子表達量的改變，是我們后續的研究方向。

目前，應用于臨床HLA的檢測方法主要有序列特異性寡核苷酸探針、序列特異性引物、PCR-SBT、NGS等[3-5]。PCR-SBT被譽為HLA基因分型的金標準，隨著等位基因數量的增加，同一位點不同等位基因序列堿基差異越來越小，造成檢測區分難度相對增加。等位基因同源性以及擴增區域等限制性因素的影響，測序結果存在多種等位基因組合在檢測區域內具有相同的雜合序列，模棱兩可組合出現越來越多[6-7]。在HLA PCR-SBT分型過程中存在模棱兩可組合時，需要通過增加檢測外顯子測序范圍、組特異性引物單鏈擴增、特異性引物測序、NGS等方法進一步區分。本文中3例樣本在使用PCR-SBT（Sanger法）檢測時，HLA-A位點均發生了堿基變異，但無法確認變異堿基位于哪一條染色體上，當用原方法復試排除了人為因素及實驗誤差的影響后，我們采用了NGS測序，得到了新等位基因的堿基序列，從而鑒定了3個HLA-A新等位基因。NGS采用了大規模矩陣結構的微陣列分析技術，將所有短的單體型DNA片段序列與數據可參考序列比對，通過擬合計算，拼接成完整的全長序列。NGS技術應用于HLA等位基因測序主要有兩個優勢，第一，針對HLA單鏈測序，分別得到特定單一等位基因序列，很大程度上減少了模棱兩可的結果；第二，NGS技術檢測區域更廣、相位分明，在HLA高分辨分型中鑒定出大量的新等位基因和罕見等位基因，極大豐富了人類HLA數據庫及其多態性，也為選擇最適供者提供更多信息。

截至2021年1月, HLA-A位點的等位基因數目已達6 425個，其中HLA-A*02家族包含了1 410個等位基因（A*02:01:01:01-A*02:954)，為多態性最高的等位基因家族，在不同地區和種族中的分布存在較大差異。世界三大主要人種的HLA-A*02等位基因的頻率分別為：北美高加索人0.289 5，北美黑人0.185 7，東方人0.335 5[8]。在中國人中HLA-A*02更為常見，且南北方差異不大，南方漢族0.337 0，北方漢族0.367 0，西安地區漢族0.300 3[9]。自本實驗室2010年開展對HLA進行SBT檢測以來，在對17 000份造血干細胞捐獻者的檢測中未發現A*02:897、A*02:898、A*02:899的其他個體，所以推測這三個等位基因為罕見型，下一步將對先證者進行家系調查，明確新等位基因是屬于穩定遺傳還是個體變異，以及新等位基因所在的單體型、座位間連鎖情況及其地域性、遺傳情況等，進一步深入研究新等位基因在人群中的頻率分布及功能。

近年來，隨著HLA分型技術的廣泛應用和中華骨髓庫的不斷壯大，新的HLA等位基因不斷被發現和報道。新基因的發現，擴大了HLA遺傳系統的多樣性，豐富了HLA數據庫，為需要進行器官移植和造血干細胞移植的患者找到更適宜的供者，減少急性排斥反應的發生，提高了移植存活率；同時也為研究HLA與疾病相關性、親子鑒定、個體識別以及群體遺傳學等提供必需的基本數據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突