5 個綿羊群體LHR 基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

邵順成，閆背背，張?zhí)炻劊?鵬，鄒詩凡，李新海，馮登偵

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750000）

綿羊的生殖活動受下垂體、丘腦、性腺軸等相關(guān)激素的相互調(diào)節(jié)，各種激素對綿羊的生殖活動起到至關(guān)重要的作用。促黃體素（LH）可促進卵泡發(fā)育和排卵，其對卵巢發(fā)育的作用由促黃體素受體（Luteinizing Hormone Receptor,LHR）介導(dǎo)，LHR的表達隨著排卵前卵泡的發(fā)育而逐漸增加，綿羊LHR基因在多種組織和器官中表達，其可以促進母羊卵泡的發(fā)育和成熟[1]。LHR 是G 蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor,GPCR）超家族糖蛋白受體中的一員，該家族包含眾多膜蛋白家族，這些受體可感應(yīng)各種信號分子，激活多種細胞內(nèi)信號通路[2-3]。近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)LHR基因影響多種動物的繁殖性能，如LHR基因第11 外顯子的3 個SNPs 與牛的繁殖性狀有關(guān)[4]；Yu 等[5]人發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛LHR基因的錯義突變可能會改變LHR基因區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低LH 的活性，通過直接和間接機制增強胚胎發(fā)育，故該基因與母牛的超排卵性狀有一定的關(guān)聯(lián)性；LHR在鴨子的性腺中表達，尤其是在卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞中高表達，并且LHR表達與鴨的產(chǎn)蛋量之間存在正相關(guān)，故LHR基因在促進產(chǎn)蛋方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[6]，且研究發(fā)現(xiàn)LHR基因SNPs 與人類的多囊卵巢癥、卵巢相關(guān)疾病有一定的關(guān)聯(lián)性[7-8]，因此研究該基因的多態(tài)性關(guān)聯(lián)可能有助于更好地了解相關(guān)生殖系統(tǒng)類疾病。綿羊LHR基因位于3 號染色體上，有11 個外顯子，其對卵母細胞的發(fā)育排卵起重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，甘加藏羊在發(fā)情間期LHR 在子宮表達量最高，尤其在宮腺體細胞、肌層平滑肌、細胞基質(zhì)細胞中分布最多，LHR基因?qū)Ω始硬匮虻姆敝称鸬搅苏{(diào)控作用[10]。FecB基因已被證實可以影響綿羊的排卵率和產(chǎn)仔數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)攜帶FecB基因母羊的卵巢和卵巢卵泡中，LHR的表達水平相對較高[11-12]，大多學(xué)者認為在卵巢中高表達的LHR會延遲優(yōu)勢卵泡的凋亡，從而增加排卵數(shù)量。

鑒于此，本實驗以寧夏5 個綿羊群體為實驗對象，將LHR基因作為影響綿羊繁殖性能的候選基因，探究LHR基因4 個SNP 位點在5 個群體中的多態(tài)性并與產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，為揭示綿羊高繁殖力調(diào)控提供分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采集5 個綿羊群體共768 只綿羊的耳組織，其中有產(chǎn)羔數(shù)記錄的599 只（表1）。實驗羊群均為母羊，來自寧夏宇泊科技有限公司。所有羊只均采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時記錄各群體母羊的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

表1 實驗羊群信息

1.2 基因組DNA 提取 綿羊血液樣本使用血液/ 組織DNA 磁珠法提取試劑盒對DNA 進行提取，DNA 質(zhì)量利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 引物設(shè)計 Mass ARRAY Assay Design 3.1 軟件用于設(shè)計LHR基因4 個位點的單堿基延伸引物和聚合酶鏈式反應(yīng)程序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 使用Microsoft Excel 2016 軟件對綿羊LHR基因的4 個位點的基因型頻率、基因頻率、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）等進行計算，并進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。用SPSS 25.0 軟件程序中一般線性模型完成5 個綿羊群體各基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，其中產(chǎn)羔數(shù)/產(chǎn)羔次數(shù)為每只羊的最終產(chǎn)羔數(shù)，結(jié)果以平均值±標準誤形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液DNA 檢測結(jié)果 利用NanoDrop 2000 超微量分光光度計和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測5 個綿羊群體羊只的DNA 純度、濃度和完整性。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所提取的DNA 單個樣品濃度都在50 ng/μL 以上，且OD260nm/OD280nm比值都在1.8～2.0 范圍內(nèi)。電泳條帶清晰，其條帶見圖1。

圖1 綿羊部分基因組DNA 電泳圖

2.2LHR基因多態(tài)性分析 通過觀察圖2 基因分型結(jié)果可知，LHR基因rs401906902 位點在雜一代、雜二代、橫交一代和灘寒羊4 個群體中有AA、AT、TT 3種基因型，在杜泊羊群體中有AA、AT 2 種基因型；rs398733991 位點在杜泊羊、雜一代、橫交一代和灘寒羊4 個群體中有CC、CT、TT 3 種基因型，在雜二代群體中有CC、CT 2 種基因型；rs424328324 位點在5個群體中有AA、CA、CC 3 種基因型；rs410734874位點在5 個群體中有AA、TA、TT 3 種基因型。

2.3LHR基因4 個位點在5 個綿羊群體中的群體遺傳學(xué)分析LHR基因rs401906902 位點在5 個群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)。rs398733991 位點在灘寒羊群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)，在杜泊羊、雜一代、雜二代和橫交一代4 個群體中表現(xiàn)低度多態(tài)。rs424328324、rs410734874 2 個位點在5 個群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗分析，rs401906902、rs398733991、rs410734874 3 個位點在5 個群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，表明這3 個位點在5 個群體中已趨于穩(wěn)定。rs424328324 位點除橫交一代群體外，在其他群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，說明這3 個群體可能不受群體選育措施的影響，處于群體遺傳平衡狀態(tài)，詳情見表2。

表2 LHR 基因4 個位點的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.4LHR基因4 個多態(tài)位點與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 對LHR基因4 個位點的不同基因型與5 個群體的產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明rs410734874 位點在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA 型，說明rs410734874 位點適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育。rs401906902、rs398733991、rs424328324 3 個位點各基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異均不顯著，不適用于綿羊多羔性狀的選育，詳見表3。

表3 LHR 基因4 個位點各基因型產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

促性腺激素受體由FSHR 和LHR 組成，在許多組織中都可以檢測到它們的表達，在顆粒細胞中，F(xiàn)SH 的刺激對于LHR 表達至關(guān)重要，但FSHR 僅與FSH 結(jié)合，而LHR 可以與LH 和人絨毛膜促性腺激素（hCG）相結(jié)合，LHR基因的啟動子包含特異性蛋白1（SP1），類固醇生成因子1 和AP-2 的結(jié)合位點，在這些結(jié)合位點中，據(jù)報道SP1 結(jié)合位點對于激活cAMP 誘導(dǎo)的LHR轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[13-14]。Pakarainen 等[15]人發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠的LHR基因后，高劑量的FSH 也不能誘導(dǎo)小鼠卵泡的發(fā)育和排卵，所以該基因?qū)β殉差惞檀技に氐漠a(chǎn)生和卵泡的成熟至關(guān)重要。近年來，學(xué)者加大對綿羊LHR的研究，如寸靜宇[16]等發(fā)現(xiàn)小尾寒羊LHR基因的3個位點（g.75747421A＞C、g.75748150A＞G、g.75741060A＞C）與小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)呈顯著性相關(guān)，并且LHR基因在多羔群體卵巢與下丘腦的表達均極顯著高于單羔群體。因此研究綿羊LHR基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析對綿羊的繁殖性能具有重要意義。

本實驗利用Sequenom Mass ARRAY?SNP 技術(shù)對LHR基因4 個錯義突變位點進行檢測并進行產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)rs401906902 位點在5 個群體間表現(xiàn)為低度多態(tài)，說明該位點在5 個綿羊群體中具有較小的選擇潛力，但值得注意的是該位點TT 基因型在雜二代群體的產(chǎn)羔數(shù)均高于其他群體，在實驗基地中雜交群體母羊平均產(chǎn)羔數(shù)高于4 只的較少見，故TT 基因型可能是該群體母羊產(chǎn)多羔的遺傳標記，但因該基因型在雜二代群體中數(shù)量較少，是否會真的影響綿羊的繁殖性能需進一步深入研究。rs398733991、rs424328324 2 個位點各基因型與產(chǎn)羔數(shù)表型數(shù)據(jù)均無顯著關(guān)聯(lián)，說明這2 個位點可能不是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的優(yōu)勢位點。但王翔宇等[17]發(fā)現(xiàn)LHR基因rs424328324（g.75741060A＞C）位點在魯中肉羊第4 胎CC 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA 型和CA 型，認為增加g.75741060A＞C 位點C 的頻率，可以增加魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)，這與本實驗結(jié)果不一致，因遺傳因素和環(huán)境因素不同，具有不同遺傳背景的綿羊的繁殖能力具有差異性[18-19]。rs410734874 位點在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA型（P＜0.05），其中TT 基因型個體平均產(chǎn)羔數(shù)比TA型個體高0.49 只，說明rs410734874 位點適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育，但橫交一代群體數(shù)量較少，故后期應(yīng)加大檢測力度，以充分的證據(jù)去證明該位點的確會影響綿羊的繁殖性能。并且本課題組前期以杜泊羊、灘羊、小尾寒羊、灘寒羊為研究對象，對LHR基因的相關(guān)位點進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)s410734874 具有較高的多態(tài)性，并且灘羊的A 突變極顯著高于灘寒羊，而灘羊本來繁殖率較低，這進一步證實該基因可能影響綿羊的繁殖性能[20]。

4 結(jié) 論

本研究表明：rs410734874 位點在橫交一代群體中與產(chǎn)羔數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)性，其中TT 型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于TA 型，說明rs410734874 位點適用于橫交一代綿羊群體多羔性狀的選育；rs401906902、rs398733991、rs424328324 3 個位點各基因型之間產(chǎn)羔數(shù)差異均不顯著，不適用于綿羊多羔性狀的選育。本研究為進一步尋找控制綿羊多羔性狀的分子遺傳標記位點提供參考。