高效液相色譜-串聯質譜法同步檢測飼料中4 種常見霉菌毒素

陳 甫，朱風華，韋 寧，王倩文，王雪琪，陳雪曉，李景景，朱連勤

（青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109）

霉菌毒素是由產毒真菌在適宜的環境條件下產生的有毒代謝產物，種類繁多，在自然界分布廣泛，超過300 多種可在糧食生產、加工運輸和貯藏等環節產生毒素[1-2]。據聯合國糧農組織資料顯示，全世界每年約有25% 的農作物不同程度地受到霉菌毒素污染，失去營養和經濟價值，造成的損失可達數千億美元[3-4]。霉菌毒素可以通過飼料或食品進入食物鏈，損傷肝臟、腎臟和神經組織等，導致畜禽生產性能下降、免疫抑制和死亡，嚴重威脅著畜牧業生產和畜產品質量安全[3-5]。我國是霉菌毒素污染的重災區，黃曲霉毒素B1（AFB1）、嘔吐毒素（DON）、伏馬毒素B1（FB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等多種霉菌毒素的污染尤為嚴重[3,6-8]。嚴格控制霉菌毒素對糧食及其加工產品的污染是保障人類和動物健康的必然要求，而檢測和調查飼料中霉菌毒素的污染是防控霉菌毒素危害的重要手段之一。現今，霉菌毒素的檢測方法主要有液相色譜法、熒光光度法、酶聯免疫吸附法、薄層色譜法和液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS）等[9-12]。與其他方法比，HPLC-MS 法不需要用免疫親和柱等凈化柱進行固相萃取，進行多個樣品檢測時具有精確度高、簡便、快速、成本較低等優勢，可同時測定樣品中的多種霉菌毒素[9-12]。而利用HPLCMS法同時檢測飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 等主要霉菌毒素的研究報道較少[8]。因此，本研究在探索毒素提取方法的基礎上，建立了能同時測定飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 等4 種毒素的HPLC-MS 法，以期為飼料中霉菌毒素的檢測、污染調查及風險評估提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本試驗所用樣品采集自山東部分地區不同廠家生產的飼料，采樣方法按照國家標準（GB/T 14699.1-2005）進行，共采集濰坊、青島、煙臺三地飼料廠肉雞配合飼料20 份和玉米34 份。樣品處理前-20.0℃保存，處理時從冰箱取出，恢復至常溫，混勻后應用粉碎機碎粉，過40 目篩，備用。

1.2 主要儀器與試劑 高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀（1290 Infinity/6460 HPLC-MS，Agilent 公司）、粉碎機（HC-400Y，永康市石柱鉑歐五金廠）、分析天平（JA2003A，上海精天電子儀器有限公司）、漩渦混勻器（MX-S/F，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司），C8 柱：150.0 mm×3.0 mm，粒徑 3.0 μm。AFB1、FB1、ZEN 和DON 毒素標準溶液和ELISA 檢測試劑盒（青島普瑞邦生物工程有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克）、純甲醇（色譜純，德國默克）、甲酸（色譜純，美國FISHER），醋酸銨（色譜純，ACS 恩科）。

1.3 高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）法

1.3.1 樣品處理條件優化 稱取樣品5.0 g，加入50 mL 離心管中，加入提取液25 mL 進行提取，渦旋混勻2 min，置氣浴搖床中提取1 h；取出樣品，定量濾紙過濾，濾液經0.22 μm 有機濾膜過濾，待測。

1.3.1.1 提取液的篩選 稱取同一樣品25 份，每份5.0 g，分為5 組，每組5 個重復。每組分別加入以下5 種提取液（表1）：84%乙腈:水、50%乙腈:水、75%甲醇:水、50%甲醇:水、水25 mL 進行提取，按照上述處理后待測。

表1 5 種毒素提取液配比

1.3.1.2 氮吹干試驗 稱取同一樣品10 份，隨機分為2 組，每組5 個重復。每個重復加入乙腈:水（84:16，V/V）25 mL 進行提取，按照上述處理后得濾液。一組取濾液經0.22 μm 濾膜過濾直接檢測，另一組在50℃下氮吹干，殘留物加1.0 mL 乙腈:水溶液，0.22 μm 濾膜過濾，待測。

1.3.2 液質條件 以各毒素標準品為檢測對象，在正負離子模式下進行全掃描，形成掃描檢測圖，以選擇合適的準分子離子峰和電離方式，確定每種毒素的掃描模式。依據基質空白同基質標準溶液的離子掃描圖，優化錐孔電壓、碰撞能量等儀器的參數，把每個檢測離子的強度調節到最高，尋找各毒素在多反應檢測模式下相應的特征離子對，確定最佳質譜條件。

1.3.2.1 洗脫條件 C8 色譜柱柱溫25～33℃，進樣量20.0 μL，流動相為1.0%甲酸醋酸銨溶液，梯度洗脫流速條件見表2。

表2 ESI 源梯度洗脫條件

1.3.2.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正負離子掃描，檢測方式為多反應監測。質譜測定參數見表3。

表3 質譜測定參數

1.4 標準曲線的繪制 將不同濃度的毒素梯度標準樣品分別進行測定，以峰面積（x）為橫坐標，毒素濃度（Y，μg/L）為縱坐標，進行線性回歸，計算線性范圍、系數（R2）、線性回歸方程。

1.5 加樣回收率和精密度試驗 取配合飼料、玉米各12份，共計24 份，每份5.0 g。每類樣品12 份分別加入3 個濃度水平（50、100、500 μg/kg）的AFB1、FB1、ZEN 和DON，按照1.3 進行樣品處理和毒素檢測，平行測定6 次，觀察方法的精密度和回收率。

1.6 重復性試驗 取一份配合飼料和玉米樣品，按照樣品制備方法平行制備8 次，分別測定AFB1、FB1、ZEN和DON 含量，計算各毒素的相對標準偏差（RSD）值。

1.7 統計分析 應用SPSS 22.0 統計分析軟件對提取液、氮吹干試驗毒素檢測結果進行單因素方差分析，并應用Duncan's 多重比較進行差異顯著性檢驗，試驗數據用（平均值± 標準差）表示，差異顯著水平為P＜0.05。回收率、精密度和重復性試驗檢測結果用平均值表示，計算RSD 值，判定回收率、精密度和重復性。

2 結果與分析

2.1 質譜定性定量分析結果 分別在正離子和負離子模式下對4 種霉菌毒素的標準溶液進行全掃描，發現DON、FB1和AFB1在正離子模式下響應高，ZEN 在負離子模式下響應高。對4 種毒素的標準溶液在正負離子模式下進行全掃描，AFB1、DON、FB1和ZEN 分別得到313.1、722.4、297.2 和 317.0 準分子離子峰。將不同毒素對應的峰分別進行二級質譜全掃描。AFB1、FB1、DON 在正離子模式下形成的定量離子對為313.1、297.2 和722.4，ZEN 在負離子模式下形成的定量離子對為 317.0，AFB1、DON 和FB1在正離子模式下形成的定性離子對為241.0、334.1、265.1 和ZEN 在負離子模式下形成的定性離子為175.1。應用HPLC-MS 法檢測4 種霉菌毒素色譜圖發現，FB1在2.8～3 min 出峰，AFB1在3.8～4 min 出峰，DON 在4.7～4.9 min 出峰，ZEN在5.1～5.3 min 出峰。

2.2 樣品前處理條件結果

2.2.1 不同提取液對毒素檢測結果的影響 如圖1 所示，應用不同的提取液對同一樣品中的4 種霉菌毒素提取檢測后發現，應用84%乙腈水、75%甲醇水和50%甲醇水提取FB1優于50%乙腈水和水，應用84%乙腈水提取AFB1優于其他4 種提取液，應用84%乙腈水和50%乙腈水提取DON 優于其他3 種提取液，應用84%乙腈水和水提取ZEN 優于其他3 種提取液。綜上所述，選取84%乙腈水作為AFB1、FB1、ZEN 和DON 的提取液。

圖1 5 種提取液對4 種霉菌毒素提取效果的比較

2.2.2 氮吹干對毒素檢測結果的影響 由圖2 所示，樣品經氮氣吹干濃縮5 倍后，AFB1、FB1、ZEN 和DON濃度均較未濃縮時的毒素濃度顯著下降。這說明毒素在氮氣吹干的過程中可能會因揮發導致回收率下降，檢測值降低。若檢測過程需要濃縮，建議降低氮氣吹干的溫度或加入保護劑。

圖2 氮吹干對4 種毒素檢測結果的影響

2.3 標準曲線與檢出限結果 將毒素標準樣品根據配合飼料和原料中的毒素含量倍比稀釋，AFB1、FB1、ZEN、DON 濃度分別在0.01～1 000 μg/kg、10～2 000、0.1～2000、10～100 000 μg/kg 時，峰面積和毒素濃度呈現出良好的線性關系，相關系數R2值均在0.99 以上，如圖3 所示。另外，本方法AFB1、FB1、ZEN 和DON的檢出限分別為0.005、10、10、0.1 μg/kg，定量限分別為0.01、10、1.0 μg/kg 和1.0 μg/kg，說明同時檢測DON、AFB1、FB1和ZEN 的HPLC-MS 法靈敏度高。

圖3 HPLC-MS 法檢測AFB1、FB1、ZEN 和DON 毒素的標準曲線

2.4 回收率和精密度結果 由表4 可知，DON、AFB1、FB1和ZEN 檢測回收率分別為95.93%～100.29%、95.12%～106.04%、99.83%～103.28%、98.73%～100.73%，RSD值分別為0.18%～1.58%、3.20%～3.61%、0.32%～1.70%、0.95%～0.98%。說明同時檢測DON、AFB1、FB1和ZEN 的HPLC-MS 法回收率高，精密度好。

表4 不同毒素在基質中的加樣回收率和精密度

2.5 重復試驗結果 配合飼料和玉米樣品平行8 次檢測，計算得出AFB1、DON、FB1和ZEN 的RSD 值為0.26%、0.08%、3.52% 和0.20%。說明本方法檢測AFB1、DON、FB1和ZEN 重復性良好。

3 討 論

3.1 樣品前處理條件優化 毒素的提取處理對檢測方法的準確性至關重要，而不同毒素在水和有機溶劑中的溶解度不同，提取率也不相同。因此，選擇提取率高的毒素提取液能同時提取多種霉菌毒素至關重要。本研究利用5 種提取液對4 種毒素進行提取，結果發現84% 乙腈水提取AFB1、FB1、ZEN 和DON 的效果優于其他4種提取液。這與朱聰英等[13]研究結果相同。趙健等[14]和辛媛媛等[15]研究發現，乙腈-水-甲酸混合液提取大米和玉米中的真菌毒素效果好，回收率高。趙健等[14]研究發現，乙腈-水-甲酸混合液提取小麥中的真菌毒素效果好，回收率高。本研究沒有在提取液中加入甲酸，需要在以后的實驗中進一步研究。另外，為提高毒素檢測的精確度，多項研究均在毒素提取后對提取液進行了濃縮，而未對氮吹干技術進行驗證。本研究經過對氮吹干技術探索，發現經氮吹干濃縮提取液后4 種毒素的濃度均較未濃縮時的毒素濃度顯著下降。溶劑和溫度均能對毒素濃度產生影響，毒素在氮氣吹干的過程中可能會因溫度高和揮發導致回收率下降，檢測值降低[16]。若檢測過程需要濃縮，建議降低氮氣吹干的溫度或加入保護劑。因此，檢測樣品中毒素進行提取后，為提高毒素檢測精度，應對氮吹干技術對毒素檢測效果的影響進行評測。

3.2 液質條件的優化 液質條件是決定HPLC-MS 法分離目標化合物與檢測成功的關鍵，目標化合物在液相色譜柱中的分離是粗分離，進入質譜后，由一級質譜選擇母離子，將其打碎，再由二級質譜選擇碎片離子，從而進行定性定量。通過正離子模式和負離子模式的全掃描可選擇合適的準分子離子峰和電離方式。霉菌毒素的極性較弱，通過HPLC-MS 法在正離子和負離子模式下進行全掃描，AFB1、FB1、DON 在正離子模式下形成定量離子，ZEN 在負離子模式下形成的定量離子對。通過色譜圖發現色譜峰保留時間適中，峰形較好，說明色譜峰響應較好。這些結果與應永飛等[17]和鄭榮等[10]的研究結果相似，是檢測此4 種毒素較好的液質條件。

3.3 方法可行性分析 方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用，并已成為質量研究和質量控制的重要組成部分，其中，線性、回收率、精密度和重復性試驗等是評價分析檢測方法確實可行的主要檢驗項目和驗證指標。本研究發現，HPLC-MS 法檢測飼料中AFB1、FB1、ZEN 和DON 的峰面積和毒素濃度呈現出良好的線性關系，檢出限和定量限均較低，回收率和精密度高，重復性良好。通過前期的調查應用，確定了HPLC-MS 法能同檢測多種飼料中的AFB1、FB1、ZEN和DON[8]。這些結果進一步說明HPLC-MS 法檢測霉菌毒素確實可行，而且具有簡便、快速、準確度高和靈敏度好的優點[18-20]。

4 結 論

本研究建立同時檢測飼料中4 種霉菌毒素的HPLC-MS 法，經線性、精確度、精密度和重復性試驗，確認本方法簡單、快速、線性良好、精密度高、重現性好，適用于飼料中霉菌毒素的定量定性檢測。