P3H家族基因在膀胱尿路上皮細胞癌組織中的表達及其預后意義

陳炎鋒 何孝永

膀胱尿路上皮細胞癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的復發率和死亡率[1]。目前雖有大量研究對BLCA的發生、發展和轉移機制等作了探討，但是對BLCA的分子特征仍然未知。筆者認為，篩選鑒定BLCA相關腫瘤標志物并探究相關機制，將有助于發現新的治療方案。脯氨酰3-羥化酶（prolyl 3-hydroxylase，P3H）主要包括 P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，其中P3H4已被證實與泌尿系腫瘤相關[2]。目前關于不同P3H家族基因在BLCA的發生、發展中的具體作用尚未知曉。因此，本研究對不同P3H家族基因在BLCA組織中的表達及其預后意義作一探討，以期為BLCA的臨床診治提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 從癌癥基因組圖譜數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx數據庫獲取435例BLCA患者的臨床數據，其中男309例，女126例；年齡69（60，77）歲；腫瘤TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期130例，Ⅲ期142例，Ⅳ期138例。

1.2 數據獲取 （1）BLCA與癌旁正常組織中P3H家族基因表達水平的數據：使用UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）經Toil流程統一處理的TPM格式的RNAseq數據并進行log2轉化后獲得。（2）臨床相關性及預后分析數據：將數據庫中HTSeq-FPKM格式的RNAseq數據轉換成TPM格式，并進行log2轉化后獲得。

1.3 統計學處理 采用R 3.6.3統計軟件。不符合正態分布的計量資料組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P3H家族基因表達水平的中位數為分界點分為高、低表達組，繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗比較兩組總體生存率。繪制ROC曲線分析P3H家族基因表達水平預測患者預后的效能，AUC為0.5～＜0.7提示有較低的準確度，0.7～0.9提示有一定的準確度，＞0.9提示有較高的準確度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BLCA與癌旁正常組織中P3H家族基因表達水平比較 與癌旁正常組織比較，P3H1、P3H4在BLCA組織中的表達水平均明顯升高，P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA組織中的表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 1（插頁）。

圖1 膀胱尿路上皮細胞癌（BLCA）與癌旁正常組織中脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因表達水平比較（*P＜0.05）

2.2 不同TNM分期的BLCA患者P3H家族基因表達水平比較 不同TNM分期的BLCA患者P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中Ⅰ期和Ⅱ期患者的P3H3、P3H4表達水平較Ⅲ、Ⅳ期患者明顯降低（均P＜0.05），Ⅱ期患者的P3H1、CRTAP表達水平較Ⅲ、Ⅳ期患者明顯降低（均P＜0.05）；不同TNM分期的BLCA患者P3H2表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2（插頁）。

圖2 不同TNM分期的膀胱尿路上皮細胞癌（BLCA）患者脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因表達水平比較（*P＜0.05，△P＞0.05）

2.3 P3H家族基因表達水平與BLCA患者預后的關系及預測效能分析 Kaplan-Meier生存分析顯示，P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP基因表達水平與BLCA患者的預后有關，高表達組總體生存率更低（均P＜0.05）；而P3H2基因表達水平與BLCA患者的預后無關，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 3。ROC曲線分析顯示，P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP預測BLCA患者的預后均有一定的準確度，但預測趨勢方向不一致，其中P3H1、P3H4預測方向一致，而P3H2、P3H3、CRTAP預測方向一致。與P3H1（AUC=0.774）相比，P3H4（AUC=0.837）的預測效能更高；與 P3H3（AUC=0.643）和 P3H2（AUC=0.724）比較，CRTAP（AUC=0.825）的預測效能更高，見圖 4。

圖3 膀胱尿路上皮細胞癌（BLCA）患者脯氨酰 3- 羥化酶（P3H）家族基因高、低表達組的生存曲線（a：P3H1；b：P3H2；c：P3H3；d：P3H4；e：CRTAP）

圖4 不同脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因預測膀胱尿路上皮細胞癌（BLCA）患者預后的的ROC曲線（a：P3H1、P3H4；b：P3H2、P3H3、CRTAP）

3 討論

既往研究表明，P3H家族基因及其突變與人類疾病有關，其根本原因主要與膠原蛋白改變有關[3]。目前已在人類基因組中鑒定出5種P3H家族蛋白，即P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，均屬于內質網駐留蛋白，其中P3H1、P3H2和P3H3均具有高度保守的2-酮戊二酸，抗壞血酸和Fe（Ⅱ）依賴性雙加氧酶結構域，可以羥化特定脯氨酸殘基；而P3H4、CRTAP（軟骨相關的蛋白）缺少酶結構域，但與P3H其他家族基因的N端部分具有顯著相似性[4]。盡管已明確P3H家族某些成員在BLCA中起關鍵作用[2，5]，但仍需要闡明P3H家族成員在BLCA中的不同作用。因此，本研究對不同P3H家族基因在BLCA中的表達及預后意義作一探討。

本研究結果顯示，P3H1、P3H4在BLCA組織中表達明顯升高，而P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA組織中的表達明顯低于癌旁正常組織。對于不同TNM分期患者，BLCA 組織中 P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP 表達存在明顯差異，而預后分析顯示P3H家族基因高表達與BLCA患者總體生存率較低有關；此外，P3H2與BLCA患者的TNM分期及生存預后均無關，原因可能是P3H2僅在膠原蛋白鏈組裝、穩定性和交聯中發揮關鍵作用[6]。本研究ROC曲線分析顯示，不同P3H基因的預測趨勢方向并不一致，這可能與其是促癌基因還是抑癌基因有關。P3H3、P3H2、CRTAP的預測趨勢方向一致，其中CRTAP的預測效能更高。研究表明，CRTAP和P3H1在內質網中形成穩定的三聚體復合物脯氨酰3-羥基化復合物，該復合物還包含親環蛋白B、脯氨酰順反異構酶[7]，對于適當的膠原蛋白修飾和內質網中的折疊至關重要。而P3H3、P2H2同樣是適當的膠原生物合成、折疊和組裝所必需的，當編碼P3H2的基因突變與至少2個不同家族中的隱性嚴重近視有關，并可能影響眼睛的膠原蛋白修飾[8-9]。此外，P3H2、P3H3、CRTAP 基因的表觀失活與腫瘤的發生有關，這表明它可能作為腫瘤抑制因子發揮作用，但具體機制仍未知[3]。此外，P3H1與P3H4的預測趨勢方向一致，其中P3H4的預測效能更高；這與Hao等[10]研究結果相似。Chen等[2]研究發現，升高的TPST1或P3H4表達與總體生存率較低、腫瘤病理分期較高等顯著相關。P3H4不僅在BLAC組織中高表達，且具有較高的臨床預后及腫瘤預測價值。P3H4最初被鑒定為與締合復合體（SC）相關的蛋白質[4]，參與多種生理過程，如內質網中纖維狀膠蛋白翻譯后修飾，與P3H3形成穩定的復合物，可催化膠原蛋白α鏈中賴氨酸殘基的羥基化，與賴氨酰羥化酶1和親環蛋白B相互作用來調節骨量穩態和皮膚脆弱性[11-12]。此外，P3H4還可以作為銜接蛋白，連接髓磷脂蛋白零（P0）及活化的蛋白激酶C受體），從而降低P0的磷酸化和黏附功能，誘發遺傳性周圍神經病變[13]。隨后研究發現，P3H4與間質性膀胱炎、膜性腎病、前列腺癌等疾病相關的自身抗原有關，而泌尿系統的自身免疫性破壞在BLCA發病機制中至關重要[2，4]。

綜上所述，在BLCA的發生、發展過程中，P3H2、P3H3、CRTAP可能作為抑癌基因而P3H1、P3H4可能作為促癌基因發揮作用，其中P3H4對BLCA患者預后的預測價值較高。但本研究也存在一定的局限性，如所有數據來自數據庫、未評估P3H家族基因在BLCA中的潛在診斷及治療作用等。