印度刺猬蛋白基因敲除對腓骨骨折小鼠愈合的影響*

劉超，張焱祥，王顯勛，李勇光

(江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院 骨科,湖北 武漢 430000)

近年來，各種骨折的發(fā)生率明顯增加，其中肢體骨折是骨折的主要類型[1]。骨折的治療包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療,為了獲得更好的治療效果，臨床上通常采用外固定、切除內(nèi)固定、髓內(nèi)釘固定等方法[2]，但術(shù)后骨的發(fā)育和生長也是康復(fù)的重要因素。骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，而肢體骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內(nèi)成骨[3]，既往研究發(fā)現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨過程與各種內(nèi)分泌激素及相關(guān)生長因子的調(diào)控有關(guān)，這些內(nèi)分泌激素及相關(guān)生長因子通過復(fù)雜的相互作用和一系列正、負(fù)反饋來調(diào)控骨骼的發(fā)生和生長[4]。印度刺猬蛋白(Ihh)是Hedgehog家族成員之一，在所有生物系統(tǒng)中都能檢測到其表達(dá)，在生物發(fā)育過程中起著復(fù)雜而重要的作用，是臨床調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化和增殖的信號(hào)因子[5]。本研究旨在分析Ihh基因敲除對小鼠腓骨骨折愈合的影響，為Ihh信號(hào)通路抑制劑治療骨折患者提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 40只同時(shí)存在基因型Ⅱ型膠原(Col2)a1-哺乳動(dòng)物細(xì)胞Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒(Cre ERT2)的 Ihhf1/f1小鼠，12周齡，體質(zhì)量(23.42±2.25)g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2020-0015。所有小鼠均給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合復(fù)旦大學(xué)科學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑與儀器 超凈工作臺(tái)(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)、低速離心機(jī)(山東博科集團(tuán))、倒置顯微鏡(MOTIC)、倒置熒光顯微鏡(型號(hào)DMI6000B,Leica)、臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、Micro-CT(Skyscan1176)、凝膠成像及分析系統(tǒng)(南京世研儀器)。胎牛血清(上海李記生物科技有限公司)、DMEM-高糖培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)、青—鏈霉素、PBS緩沖液、Lipofectamine 2000 (北京宜科思源科技有限公司)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)期間小鼠情況 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中2組小鼠中各有1只死亡；12周齡時(shí)對剩余38只小鼠實(shí)施無菌條件下后肢腓骨骨折造模，經(jīng)腓骨X線正側(cè)位片觀察存在明顯的骨折線即診斷為造模成功；2組中又各有1只小鼠造模后腓骨X線正側(cè)位片不合格，被剔除實(shí)驗(yàn)，最終成功造模36只，觀察組和對照組各18只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 采用Ihhf1/f1和Col2a1-CreERT2；Ihhf1/f1基因型小鼠繁育，采用PCR凝膠電泳技術(shù)鑒定新生小鼠的基因型，從新生小鼠中隨機(jī)選取Col2a1-CreERT2、Ihhf1/f1基因型小鼠40只。隨機(jī)選取20小鼠作為觀察組，出生后第1、2天腹腔注射雌激素受體拮抗劑TM(托馬西酚)溶液，誘導(dǎo)IHH基因敲除[6]；其余20只小鼠腹腔注射等量植物油作為對照組。

1.2.3腓骨骨折模型制備 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(劑量40 mg/kg)麻醉，仰臥并固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)脫毛、皮膚準(zhǔn)備和碘伏消毒，后肢腓骨中段用線鋸水平切開，將直徑為1.0 mm的克氏針逆行引入近端骨折，穿過腓骨大轉(zhuǎn)子上部，骨折復(fù)位后順行引入遠(yuǎn)端髓腔；用生理鹽水沖洗傷口，分層密封。每只小鼠注射50 000 U的青霉素以防止感染，醒后恢復(fù)進(jìn)食和自由活動(dòng)。

1.3 觀察指標(biāo)

造模后第1周、第2周及第3周末2組各取6只小鼠：(1)斷頭法處死小鼠，取腓骨，使用4%中性甲醛固定72 h行X線檢查，由3名實(shí)驗(yàn)員共同討論評價(jià)骨折線模糊程度；(2)腓骨樣本固定72 h后行Micro-CT掃描，電壓42 kV、電流555 μA、角度360°、濾過片0.2 mm、分辨率8.73 μm，行骨痂三維圖像重建分析各項(xiàng)參數(shù)；(3)處死小鼠前，抽取1 mL鼠尾靜脈血，室溫下靜置1 h，以2 500 r/min的速率離心15 min，取上層血清，采用ELISA法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、鈣與磷離子濃度，計(jì)算鈣磷乘積，采用對硝基苯磷酸鹽法測定ALP活性;(4)ABH染色，取腓骨樣本10%中性甲醛固定72 h，以10%中性EDTA脫鈣4周，然后脫水、包埋、制成蠟塊，切為3 μm組織切片，56 ℃烤片過夜，行ABH染色，中性樹脂封片，觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0分析。計(jì)量數(shù)據(jù)行重復(fù)測量方差分析與LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較為秩和檢驗(yàn)，α=0.05，Bonferroni校正法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 X線顯示骨折線

造模后3個(gè)時(shí)點(diǎn)2組小鼠腓骨側(cè)位X線片可見，隨著造模時(shí)間的延長各組小鼠的骨折線均逐漸模糊，造模后第1周2組小鼠均有清晰骨折線及不明顯骨性連接影；造模后第2周2組小鼠均有模糊骨折線，且骨性骨痂連接影增多；造模后第3周2組小鼠骨折線均模糊，且觀察組骨折線模糊和非常模糊的比例低于對照組(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 造模后不同時(shí)點(diǎn)2組小鼠骨折線模糊程度Tab.1 Comparison of the ambiguity of fracture lines between 2 groups at different times after modeling

2.2 骨折部位Micro-CT參數(shù)

隨著造模骨折時(shí)間的延長，各組小鼠Micro-CT參數(shù)中SMI逐漸降低，TV、BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th先升高后降低，Tb.Pf逐漸降低。與對照組相比，觀察組小鼠造模后第2周和第3周時(shí)Micro-CT參數(shù)中SMI、TV、BV、BV/TV、Tb.N水平均降低，Tb.Pf、Tb.Th水平均升高(P<0.05)。見表2。

注：箭頭指向?yàn)楣钦劬€。圖1 造模后不同時(shí)點(diǎn)2組小鼠腓骨骨折線(側(cè)位)Fig.1 The fracture lines between 2 groups at different times after modeling (lateral position)

表2 2組小鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)骨折部位Micro-CT參數(shù)Tab.2 Comparison of Micro-CT parameters between 2 groups at different times after modeling

2.3 血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平

隨著造模時(shí)間的延長，對照組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP、BGP水平逐漸升高，觀察組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP水平逐漸降低，BGP水平先降低后升高。與對照組相比，造模后第1周時(shí)觀察組小鼠的血清VEGF水平降低，造模后第2周、第3周時(shí)小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組小鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)血清VEGF、TGF-β1、ALP及BGP水平Tab.3 Comparison of serum VEGF,TGF-β1,ALP,and BGP levels between 2 groups at different times after modeling

2.4 血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積

隨著造模時(shí)間的延長，對照組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子水平先降低后升高，鈣磷乘積逐漸升高，觀察組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子、鈣磷乘積水平逐漸升高。與對照組比較，造模后第2周和第3周時(shí)觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均升高、血清磷離子均降低(P<0.05)。見表4。

表4 2組小鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積比較Tab.4 Comparison of serum calcium,phosphorus ion concentrations,and calcium and phosphorus product between 2 groups at different times after modeling

2.5 ABH染色

ABH染色結(jié)果顯示，造模后第1周2組小鼠骨痂可見較多軟骨成分；造模后第2周2組小鼠軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；與造模后第1周和第2周比較，造模后3周觀察組小鼠僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁小于于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。見圖2。

注：A、C、E分別為對照組第1周、第2周和第3周，B、D、F分別為觀察組第1周、第2周和第3周；綠色箭頭(黑色部位)為肌肉，紅色箭頭(白色部位)為骨骼。圖2 造模后不同時(shí)點(diǎn)2組小鼠ABH染色情況(50×)Fig.2 ABH staining between 2 groups at different times after modeling(50×)

3 討論

骨折患者臨床治療中骨組織的形成是康復(fù)的重要過程，骨組織的形成是通過不同細(xì)胞高度協(xié)調(diào)的過程，而四肢骨發(fā)生的主要形式為軟骨內(nèi)成骨，該過程內(nèi)包括間葉細(xì)胞群形成軟骨原基，軟骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟，血管侵入，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞出現(xiàn)，礦化幾個(gè)過程[7-8]。已有研究表明，Ihh信號(hào)通路與骨性關(guān)節(jié)炎和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，且Ihh信號(hào)通路在軟骨內(nèi)成骨以及骨的生長中也很重要[9-10]。隨著人口老齡化的加劇，老年人群骨性關(guān)節(jié)炎或腫瘤的發(fā)生率增高，易發(fā)生骨折[11]。本研究分析了Ihh基因敲除對腓骨骨折小鼠愈合的影響，以期為今后當(dāng)患有骨性關(guān)節(jié)炎或腫瘤患者出現(xiàn)骨折時(shí)，通過Ihh信號(hào)通路抑制劑來干預(yù)骨折愈合，從而開辟新的治療途徑，獲得更佳的臨床療效。

已有研究指出，Ihh可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和肥大，調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨的形態(tài)發(fā)生，它的作用非常復(fù)雜，需要在甲狀旁腺激素相關(guān)肽Ihh的表達(dá)和間接調(diào)控過程中進(jìn)行，Ihh可以抑制肥大軟骨細(xì)胞的分化，特別是當(dāng)甲狀旁腺激素相關(guān)肽缺乏時(shí)，Ihh不能依賴于促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大[12-15]。因此，在Ihh缺失的情況下，甲狀旁腺激素相關(guān)肽可以抑制膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源家族的轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制下游基因的表達(dá)[16]。通過IHH條件基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Ihh信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過程中的病理變化有關(guān)，敲除Ihh基因可在組織、細(xì)胞和分子水平上預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨的破壞[17-18]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲除Ihh基因的小鼠四肢較短，軟骨細(xì)胞增殖減少[19-20]。其次Ihh在出生后骨發(fā)育中起著重要作用[21-22]。MicroCT是一種全面、三維、準(zhǔn)確的骨骼微結(jié)構(gòu)檢測方法，能有效描述組織的三維結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了病理切片、X線等二維觀察方法的不足[23-24]。本研究中采用托馬西酚溶液抑制雌激素活性的化合物，可抑制機(jī)體的生長發(fā)育過程，減少對增殖型與肥大型軟骨細(xì)胞過渡區(qū)域的刺激，抑制Ihh的分泌，因此托馬西酚溶液能夠有效敲除Ihh基因。進(jìn)一步通過提取肋軟骨細(xì)胞總RNA并測定Ihh基因是否敲除成功，所納入的40只小鼠均成功敲除Ihh基因，常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中兩組中各1只死亡，12周齡時(shí)對剩余38只小鼠實(shí)施無菌條件下腓骨骨折造模，最終成功造模36只。造模后3周兩組小鼠骨折線均非常模糊，且觀察組程度較低，造模后2周、3周時(shí)對照組小鼠的Micro-CT各參數(shù)均優(yōu)于觀察組。VEGF是特異性較高的促學(xué)管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)血管通透性增加，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血管形成，其水平降低時(shí)不利于腓骨骨折小鼠的血管增生；TGF-β1為一種多功能蛋白質(zhì)，對細(xì)胞的生長、分化、凋亡和免疫等均有重要的調(diào)節(jié)作用，其能夠與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，進(jìn)而激活信息傳遞通路，其水平降低說明腓骨骨折小鼠的骨細(xì)胞增殖、分化能力較弱，說明骨折愈合情況不佳；ALP在臨床中常用于對肝膽系統(tǒng)、骨骼疾病的診斷和鑒別，其水平降低常預(yù)示著人體出現(xiàn)重癥慢性腎炎、貧血、甲狀腺機(jī)能不全等，說明腓骨骨折小鼠術(shù)后愈合情況不佳；BGP是骨代謝中常用的生化標(biāo)志物，其由成牙質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞合成，少量由增生的軟骨細(xì)胞合成，可調(diào)節(jié)骨鈣代謝，其水平降低不利于骨性骨痂的生成及骨折的愈合。且造模后2周、3周時(shí)觀察組小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均低于對照組，造模后2周、3周時(shí)觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均高于對照組。這說明Ihh基因敲除后骨折中晚期骨折區(qū)域內(nèi)VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平表達(dá)均降低，會(huì)抑制骨痂成骨，影響骨折預(yù)后，這與既往研究中的結(jié)果相似。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，ABH染色圖片顯示造模后1周兩組骨痂可見較多軟骨成分；造模后2周兩組軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；由圖可見與造模后1周、2周相比，造模3周觀察組僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁形狀明顯小于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。這可能與骨折區(qū)域的VEGF、TGF-β1、ALP、BGP表達(dá)相關(guān)，而Ihh基因敲除后上述因子表達(dá)水平降低，因此損傷區(qū)域血管新生受到抑制，纖維骨痂軟骨內(nèi)成骨抑制[25]。

綜上所述，Ihh基因敲除會(huì)抑制腓骨骨折小鼠血管增生，降低鈣磷水平，進(jìn)而影響骨性骨痂的生成，延緩骨折的愈合。但是本研究中尚未明確其具體作用機(jī)制，今后仍需進(jìn)一步探究和完善，以提高臨床應(yīng)用性。