不同曲霉感染大蠟螟幼蟲模型的構建及曲霉毒力評價*

楊碧，劉翔，張明山，田詢，江銀輝*

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

自20世紀80年代以來，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的發病率在全球范圍內發生了一些變化，以往常見的白念珠菌感染表現出下降趨勢，而由煙曲霉和黃曲霉菌導致的侵襲性曲霉病的發病率呈上升趨勢[1-4]。構建曲霉菌感染模型是研究曲霉病的前提條件，目前常見的用于構建曲霉感染的動物模型有大鼠、小鼠及兔等[5]，這些動物模型不僅成本高、還存在倫理問題，故而阿米巴變性蟲、線蟲、果蠅及大蠟螟幼蟲成為了最常見的替代模型[6-7]。大蠟螟(GalleriamellonellaL．)為鱗翅目螟蛾科蠟螟亞科蠟螟屬昆蟲，其幼蟲免疫系統由細胞免疫和體液免疫構成，與哺乳動物相似[8]；吞噬細胞介導幼蟲的細胞免疫，體液免疫應答包括蟲體黑化、調理素和抗菌肽的產生，其中黑化是由于幼蟲黑色素的形成以及沉積造成的[9]。此外，大蠟螟幼蟲繁殖能力強，生長周期短，容易飼養，無自殘性，實驗操作簡單，且無需倫理審查[10-11]。故而，大蠟螟是一個合適的昆蟲模型[12]。目前，研究人員多用大蠟螟感染模型檢測抗真菌、抗細菌類藥物藥效及菌株耐藥性等[13-14]，而對曲霉菌株間毒力檢測及比較的報道較少。因此，本研究利用大蠟螟幼蟲構建煙曲霉和黃曲霉感染模型，用于評價曲霉致病力，為研究針對病原體的免疫反應和評估抗真菌藥物的效果等實驗提供技術基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株和昆蟲 煙曲霉菌株ygy來源于病人腦脊液，黃曲霉菌株LD-F來源于呼吸科病房空氣；大蠟螟幼蟲120條，體質量為200～280 mg/條，老熟幼蟲，通體為淺黃色、無斑點，購自天津惠裕德生物科技有限公司，置于37 ℃黑暗環境培養。

1.1.2主要試劑和儀器 LEICA DM500顯微鏡和生化培養箱(天津賽得利斯)，恒字PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱，GENESPEED 1730R離心機、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、吐溫-80及Neubauer血細胞計數板(北京索萊寶)，微量注射器(上海安亭)。

1.2 實驗方法

1.2.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)制備 稱取馬鈴薯200 g、葡萄糖200 g及瓊脂粉13 g，蒸餾水加至體積1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2菌懸液制備 將煙曲霉ygy和黃曲霉LD-F分別接種于PDA培養基上，30 ℃培養5 d，含0.1%吐溫80的PBS 10 mL沖洗PDA培養基表面的菌絲，滅菌的擦鏡紙過濾，收取曲霉孢子；所得濾液8 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS再次重懸，8 000 r/min離心10 min，血細胞計數板計數；根據實驗要求調整曲霉分生孢子的質量濃度為1×108CFU/L(低劑量組)、1×109CFU/L(中劑量組)及1×1010CFU/L(高劑量組)。

1.2.3實驗分組 60條大蠟螟幼蟲隨機均分為6組，每條幼蟲參考文獻[15]方法注射煙曲霉ygy和黃曲霉LD-F孢子懸液高、中、低不同劑量各10 μL，每5條幼蟲裝于鋪有濾紙的9 cm干凈培養皿中；60條大蠟螟幼蟲隨機均分為6組，對應于2種曲霉各設置3種形式對照，即空白對照(untouched larvae,UTC)組(不做任何處理)、穿刺(pierced larvae,PC)組(微量注射器穿刺但不注射PBS)及PBS組(注射接種PBS 10 μL )。

1.2.4建立模型 參考文獻[16]方法建立感染模型，即70%乙醇浸泡棉球清洗感染組和對照組幼蟲的右側尾足區，固定幼蟲，微量注射器1×108CFU/L、1×109CFU/L及1×1010CFU/L 孢子懸液分別取10 μL注入相應劑量組的大蠟螟蟲體內；大蠟螟幼蟲置于37 ℃培養箱黑暗環境培養，監測5 d，每天記錄大蠟螟幼蟲體表顏色變化、應對刺激反饋及存活情況，當大蠟螟幼蟲對外界刺激持續無反應時認為已死亡；黑化的幼蟲死亡，再結合以下病理組織切片觀察可判斷模型構建是否成功。

1.2.5病理組織切片 高劑量組大蠟螟幼蟲感染48 h后，取UTC組和此時死亡的大蠟螟幼蟲，從幼蟲尾部縱向切開蟲體，約1 cm，浸泡于4%多聚甲醛72 h；將固定的幼蟲包埋于石蠟中，切片，蘇木精和伊紅(haema eosin，HE)染色，對幼蟲進行病理學檢查；切片進行六銨銀染色，觀察大蠟螟幼蟲體內菌絲形成情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大蠟螟幼蟲感染狀態

煙曲霉接種24 h后，各劑量組大蠟螟幼蟲開始出現黑化并死亡，未死亡的幼蟲對外界刺激反應遲鈍，但每條幼蟲的黑化程度與接種孢子懸液質量濃度無明顯相關；UTC組、PC組和PBS組大蠟螟幼蟲無死亡，通體呈淺黃色、無色斑，行動活躍，應對所受外界刺激反應靈敏。黃曲霉接種24 h后，高劑量組大蠟螟幼蟲開始出現黑化并死亡，低劑量組與中劑量組幼蟲無死亡，但多數幼蟲在應對外界刺激時反應微弱；黃曲霉接種48 h后出現大量幼蟲黑化后死亡，其黑化程度無規律；UTC組、PC組和PBS組大蠟螟幼蟲無死亡，外觀無明顯變化，應對所受外界刺激反應靈敏。見圖1。

圖1 各組大蠟螟幼蟲干預48 h后的一般狀態Fig.1 The general status of G. mellonella larvae in each group after 48 h intervention

2.2 體腔組織的病理特征

高劑量煙曲霉組和高劑量黃曲霉組大蠟螟幼蟲接種曲霉孢子懸液后，蟲體均發生黑化、死亡，HE切片可見幼蟲體腔結構遭到破壞，但UTC組幼蟲體腔結構完整；六銨銀染色切片可見煙曲霉高劑量組和黃曲霉高劑量組幼蟲體腔內有真菌菌絲團，但UTC組幼蟲體腔無真菌菌絲著色。見圖2。

2.3 存活率

煙曲霉接種24 h時，低、中、高劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為80%(8/10)、90%(9/10)及90%(9/10)；接種48 h和72 h時，3組大蠟螟幼蟲存活率分別為70%(7/10)、90%(9/10)、20%(2/10)和70%(7/10)、70%(7/10)、0%(0/10)；接種96 h時，低、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為60%(6/10)、30%(3/10)；接種120 h時，低、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為60%(6/10)和10%(1/10)；UTC組、PC組及PBS組大蠟螟幼蟲存活率為100%(10/10)；對照組與感染組存活率差異有統計學意義(P<0.000 1)。接種孢子質量濃度越高存活率越低，低劑量組、中劑量組及高劑量組存活率差異有統計學意義(P=0.000 8)。黃曲霉接種24 h時，低劑量、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率均為100%(10/10)，但高劑量組為80%(8/10)；接種48 h時，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為80%(8/10)，中劑量、高劑量組的存活率為0%(0/10)；接種72 h時，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為70%(7/10)；96 h后，低劑量組的存活率為70%(7/10)；接種120 h時，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為70%(7/10)；UTC組、PC組及PBS組大蠟螟幼蟲存活率為100%(10/10)，對照組與感染組存活率差異有統計學意義(P<0.000 1)。接種孢子質量濃度越高存活率越低，低、中及高劑量組大蠟螟幼蟲存活率差異有統計學意義(P<0.000 1)。見圖3。

注：圖中紅色箭頭所指為真菌菌絲團。圖2 各組大蠟螟幼蟲感染48 h后死亡蟲體的組織病理特征Fig.2 Histopathological characteristics of dead worms in each group of G.mellonella larvae 48 h after infection

3 討論

大蠟螟屬于昆蟲，有卵、幼蟲、蛹及成蟲4個發育階段，幼蟲的老熟階段常用于構建感染模型[17]。與線蟲相比而言，昆蟲的抗菌防御系統相對高級，因免疫系統的差異，昆蟲模型與哺乳動物模型的研究結果也存在著一定的差異[18]。但多項研究表明，大蠟螟幼蟲作為一種昆蟲模型，大部分研究結果與哺乳動物模型有正相關性[19-20]，如Brennan等[21]研究表明，白念珠菌突變體的毒力在大蠟螟幼蟲與Balb/C 小鼠體內中的測定結果一致。大蠟螟幼蟲最初是作為一種用于研究酵母菌感染的體內模型，目前已被廣泛的應用于各種微生物的研究[22-24]。大蠟螟被廣泛應用的原因在于其能于37 ℃下生長繁殖，符合人類病原體研究的重要的特征。在生物基因組的研究中，大蠟螟有許多與人類基因同源物編碼產物參與病原體的識別或信號轉導[25-27]。

研究認為大蠟螟幼蟲的黑化是由于血淋巴中酚氧化酶的激活造成，在昆蟲抵御各種病原體過程中至關重要，也是幼蟲免疫反應的一部分，感染幼蟲的黑化表現為斑駁的灰色到均勻的黑色外觀，其程度具體取決于感染的菌株[28-30]。但目前尚無研究證實大蠟螟的黑化與所感染真菌的毒力及幼蟲的載菌量有直接相關性[31]。本研究結果表明，煙曲霉和黃曲霉感染大蠟螟幼蟲后，幼蟲出現黑化、死亡，2種菌株相同劑量感染導致的黑化的程度無明顯差異，同一菌株但不同接種劑量感染導致的幼蟲黑化程度也無明顯相關，同一個處理的感染幼蟲黑化程度情況有少許差異。

此前，大量研究表明，煙曲霉菌是引起曲霉病的第一大病原菌，黃曲霉菌次之[32-33]。本研究結果提示，大蠟螟幼蟲可以承受較低的曲霉菌感染劑量，接種煙曲霉時低劑量組大蠟螟幼蟲最終的存活率為60%，接種黃曲霉時低劑量組大蠟螟幼蟲的最終存活率為70%，說明存活的大蠟螟幼蟲產生了抗曲霉的免疫應答，故而可以抵抗低劑量曲霉感染。但在最高劑量下，煙曲霉和黃曲霉都會導致大蠟螟幼蟲大量死亡，說明幼蟲免疫應答失敗中、高劑量組黃曲霉可以較短時間內殺死大蠟螟幼蟲，而煙曲霉所用時間稍長，但低劑量煙曲霉的存活率比黃曲霉低，此致病機理有待進一步研究。在病理組織切片觀察中，低倍鏡下可見煙曲霉感染大蠟螟幼蟲模型多處菌絲團，HE及六銨銀染色切片均表明煙曲霉感染后引起大蠟螟幼蟲體腔結構的破壞程度更嚴重。根據此結果推斷，煙曲霉和黃曲霉菌的毒力存在明顯不同，但2種曲霉菌接種引起的死亡率均有孢子懸液質量濃度依賴性，與既往研究結果一致[34]。因此，本研究對曲霉毒力評價的研究表明了該模型的可靠性和實用性，提示大蠟螟幼蟲可以作為構建曲霉感染的模型。

煙曲霉感染 黃曲霉感染圖3 不同曲霉感染120 h時各組大蠟螟幼蟲的存活情況Fig.3 Survival curves of the G. mellonella larvae in each group after 120 h intervention

綜上所述，利用大蠟螟幼蟲構建曲霉感染模型中，其死亡后黑化程度與曲霉毒力無相關性，但其存活率可以用于判斷菌株毒力。大蠟螟幼蟲可以快速穩定的評價曲霉的致病力，研究針對病原體的免疫反應和評估抗真菌藥物的效果等實驗提供技術基礎，為研究曲霉感染提供了一種重要的體內模型選擇。