生物被膜態(tài)和游離態(tài)臨床耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌轉(zhuǎn)錄組的差異分析*

劉巍巍，國(guó)果，吳兆穎，毛成菊，李忠旬，賈利娜，尚小麗，彭建**，吳建偉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是一種非發(fā)酵性革蘭陰性菌，屬于條件致病菌。碳青霉烯類抗生素是臨床上抗菌譜最廣，治療耐藥菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染的主要抗菌藥物[1]。目前，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistant AB，CRAB)的檢出率不斷上升，提示著臨床抗感染治療面臨重大挑戰(zhàn)[2]，而AB極易形成生物被膜，使臨床治療更加棘手[3]。生物被膜是細(xì)菌粘附于生物或非生物體表面、被自身細(xì)胞分泌的基質(zhì)(胞外多糖、蛋白質(zhì)及DNA基質(zhì))所包裹而形成的特殊結(jié)構(gòu)，可表達(dá)與游離態(tài)細(xì)菌完全不同的基因，在形態(tài)、理化性質(zhì)及抗生素敏感性等方面都有明顯的不同[4]。有研究報(bào)道，細(xì)菌形成生物被膜后對(duì)抗生素的敏感性降低，抗生素的最低抑菌濃度將提高10～1 000倍[5]。因此，進(jìn)行生物被膜及其形成機(jī)制的研究對(duì)臨床細(xì)菌感染的防控有重要意義。轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)菌在某一特定功能或狀態(tài)下、所有轉(zhuǎn)錄RNA的總和，研究臨床CRAB游離態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)菌的生理性狀和基因表達(dá)狀況，將為AB生物被膜形成機(jī)制和耐藥菌感染的治療提供科學(xué)依據(jù)[6]。有學(xué)者對(duì)AB臨床分離株1656-2的生物被膜態(tài)菌和游離態(tài)菌進(jìn)行了蛋白質(zhì)組的比較，發(fā)現(xiàn)與處理環(huán)境信息、參與代謝、細(xì)菌耐藥及基因修復(fù)有關(guān)的蛋白發(fā)生了表達(dá)變化[7]。李帥[8]對(duì)耐藥AB菌株BJAB0868的生物被膜和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)2種狀態(tài)下菌株的基因表達(dá)確實(shí)存在差異，有些基因在生物被膜態(tài)中顯著升高，在游離生長(zhǎng)狀態(tài)中極少表達(dá)甚至被抑制。但是單個(gè)菌株的比較具有特異性，且不同地區(qū)的菌株特性存在差異[9]。因此，本研究選取4株不同的臨床CRAB作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)臨床樣本，對(duì)其生物被膜態(tài)和游離態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定和差異分析，以期進(jìn)一步明確臨床CRAB生物被膜和游離態(tài)細(xì)菌的差異，為其生物被膜的產(chǎn)生機(jī)制以及藥物作用靶點(diǎn)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株 CRAB 4、55、78及117分離于住院患者痰液、血液臨床樣本，大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌，所有菌株由病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑與儀器 Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基、Trypticase Soy Broth(TSB)肉湯培養(yǎng)基及Luria-bertani(LB)固體培養(yǎng)基(北京索萊寶)，溶菌酶(上海生工)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物)，TRIZOL(美國(guó)Invitrogen)；恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè))，細(xì)菌比濁儀(上海昕瑞)，高壓蒸汽鍋(日本ALR)，微量加樣槍、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀及速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)，NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1臨床菌株鑒定及生物膜態(tài)和游離態(tài)菌株制備 CRAB 4、55、78及117作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用法國(guó)生物梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行分析鑒定與藥敏試驗(yàn)；同時(shí)，擴(kuò)增菌株16SrRNA和rpoB基因測(cè)序和分析，進(jìn)一步確定菌株鑒定的準(zhǔn)確性。挑取單菌落加入MH培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用TSB培養(yǎng)基稀釋至106cfu/L，取菌液4 mL加6孔培養(yǎng)板，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，棄游離菌液，PBS清洗3次，細(xì)胞刮刀刮取生物被膜態(tài)菌(A組)；挑取單菌落加入MH肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集游離態(tài)菌體(B組)。

1.2.2Trizol法提取RNA與質(zhì)量檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]方法，取A組和B組樣品各1 mL于4 ℃、8 000 r/min離心1 min；棄上清，加400 mg/L溶菌酶100 μL，震蕩混勻，室溫酶解5 min；4 ℃、3 000 r/min離心5 min，棄上清，加TRIZOL溶液1 mL，震蕩裂解，冰上靜置15 min；加氯仿200 μL，顛倒混勻，冰上靜置5 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加預(yù)冷的用焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水配制75%乙醇1 mL，輕輕吹打混勻，溶解沉淀；4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min；加DEPC水30～50 μL溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃保存；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解情況，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。

1.2.3文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 提取到的RNA經(jīng)檢測(cè)合格后，去除Total RNA中的核糖體RNA(rRNA)，獲得mRNA。隨后加入fragmentation buffer，將得到的mRNA隨機(jī)打斷成短片段，按照鏈特異性建庫(kù)的方式建庫(kù)[11]，即以片段化的mRNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈；隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs(將dNTP中的dTTP用dUTP取代)為原料合成cDNA第二條鏈(使第2條鏈中包含A/U/C/G)；再用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，之后進(jìn)行cDNA末端修復(fù)、加A尾、連接測(cè)序接頭，然后使用USERTM(尿嘧啶-特異性切除試劑)酶降解含U的cDNA第二鏈，PCR擴(kuò)增獲得文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)的insert size，符合預(yù)期后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.2.4讀取映射到參考基因組 以AB 030(NZ_CP009257.1)的基因組作為參考基因組，用Bowtie2軟件將過(guò)濾后的序列進(jìn)行基因組定位分析[12]。

1.2.5差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)分析 HTSeq v0.6.1用于計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)。使用DESeq軟件進(jìn)行A組與B組間的差異表達(dá)分析(每個(gè)組4個(gè)生物學(xué)重復(fù))。使用Benjamini和Hochberg的方法來(lái)調(diào)整所得P值，設(shè)置差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)[13]：校正后的P<0.05，且丨Log2(fold change)丨>1。

1.2.6DEGs的基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析 通過(guò)GOSeq R軟件實(shí)現(xiàn)差異基因的GO富集分析，并以校正P<0.05的GO Term作為差異表達(dá)基因顯著富集，通過(guò)KOBAS軟件分析差異基因在KEGG通路中的富集。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因 從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定得到的DEGs中挑取8個(gè)差異基因(表1)，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。按之前所述方法提取RNA后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系20 μL：含cDNA模板2.0 μL、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、ddH2O 6.0 μL、上下游引物各0.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，以AB 16SrRNA為內(nèi)參基因，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量

總RNA條帶完整清晰，無(wú)雜帶，樣本無(wú)污染(圖1)；通過(guò)Nano Photometer spectrophotometer檢測(cè)RNA純度，OD260/280介于1.8～2.2，OD260/230>1.8，樣品滿足后續(xù)建庫(kù)和試驗(yàn)要求。見(jiàn)圖1和表2。

注：M為marker條帶，1～4為A組總RNA，5～8為B組RNA。圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 RNA agarose gel electrophoresis

表2 RNA樣品質(zhì)量信息Tab.2 RNA sample quality information

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)

樣品測(cè)序統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示錯(cuò)誤率為0.03%，可認(rèn)為測(cè)序結(jié)果可靠；每組樣品的clean reads 數(shù)據(jù)>1 G，測(cè)序深度足夠覆蓋所有可能存在的基因。Q20和Q30分別為計(jì)算Phred 數(shù)值大于20和30的堿基占總體堿基的百分比，結(jié)果顯示Q20>95%且Q30>90%。見(jiàn)表3。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)匯總Tab.3 Sequencing data

2.3 參考序列比對(duì)分析

A組所產(chǎn)生的測(cè)序reads成功比對(duì)到基因組的總映射比例高于80%，其中具有多個(gè)定位的測(cè)序序列占總體的百分比低于6%；B組所產(chǎn)生的測(cè)序reads成功比對(duì)到基因組的總映射比例為60%左右，系樣品處理導(dǎo)致的變化，不影響測(cè)序效果。見(jiàn)表4。

表4 樣本與參考基因組比對(duì)情況統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics comparison of samples and reference genome

2.4 基因表達(dá)水平

不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各樣本的FPKM>1的基因數(shù)量約占總體的74%以上，提示有基因表達(dá)。見(jiàn)表5。

表5 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.5 Statistics of gene numbers in different expression levels

2.5 DEGs的篩選

DEGs的火山圖顯示，臨床CRAB A組與B組相比有407個(gè)基因差異表達(dá)，包括212個(gè)上調(diào)和195個(gè)下調(diào)基因。見(jiàn)圖2。

注：紅、綠點(diǎn)分別為上調(diào)和下調(diào)的DEGs，藍(lán)點(diǎn)為不顯著DEGs。圖2 DEGs火山圖Fig.2 Volcanoplot of DEGs

2.6 差異表達(dá)關(guān)鍵基因分析

上調(diào)的差異基因涉及鐵的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)、核酸和生化代謝酶類、菌毛合成相關(guān)基因等，其中，TonB依賴的鐵載體受體(IX87_RS16650)、鐵氧還蛋白還原酶(IX87_RS14470)、鐵載體生物合成蛋白(IX87_RS18700)、亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A(IX87_RS15450)、鐵螯合酶(IX87_RS16135)等基因的Log2(fold change)值為1.5～5.1；NAD(P)依賴性氧化還原酶(IX87_RS20015)、乙酰輔酶A C-酰基轉(zhuǎn)移酶(IX87_RS06095)的Log2(fold change)值分別為3.7和3.4；菌毛合成相關(guān)基因CsuA(IX87_RS06910)的Log2(fold change)值為1.89。下調(diào)的差異基因涉及鎂、硫的轉(zhuǎn)運(yùn)，無(wú)機(jī)物質(zhì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因、生化代謝酶等，其中，磺酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白(IX87_RS14420)、硫酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白(IX87_RS09105 )、氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶(IX87_RS03165)的Log2(fold change)值分別為-5.9、-5.8及-4.9；α/β水解酶(IX87_RS09110)的Log2(fold change)值為-5.4，NADH氧化酶(IX87_RS04460)為-4.3。

2.7 差異基因GO富集分析

GO富集分析結(jié)果表明最顯著的30個(gè)GO條目，酰基輔酶A脫氫酶活性、輔助因子結(jié)合、維生素結(jié)合以及物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等富集于分子功能類別，核苷轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原過(guò)程、脂質(zhì)代謝過(guò)程、氨基酸的生物合成及金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)等富集于生物過(guò)程。見(jiàn)圖3。

注：(1)P<0.05。圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

2.8 差異基因KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果表明，DEGs參與的KEGG代謝通路中最顯著的通路有20條，分別為硫代謝(sulfur metabolism)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ABC transporters)、苯甲酸酯降解(fluorobenzoate degradation)、芳香化合物的降解(degradation of aromatic compounds)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(valine,leucine and isoleucine degradation)、β-丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、卟啉和葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)、丙酸酯代謝(propanoate metabolism)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、甲烷代謝(methane metabolism)、不飽和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)、不同環(huán)境中微生物代謝(microbial metabolism in diverse environments)、甘油酯代謝(glycerolipid metabolism)、硒化合物代謝(selenocompound metabolism)、核黃素代謝(riboflavin metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、酮體的合成與分解(synthesis and degradation of ketone bodies)、丁酯酸代謝(butanoate metabolism)。另外，還涉及到萬(wàn)古霉素耐藥(vancomycin resistance)、群體感應(yīng)(quorum sensing)、陽(yáng)離子抗菌肽耐藥[cationic antimicrobial peptide (CAMP)resistance]和細(xì)菌分泌系統(tǒng)(bacterial secretion system)等。見(jiàn)圖4。

圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs

2.9 DEGs的驗(yàn)證

從轉(zhuǎn)錄組差異基因中挑選8個(gè)基因，其中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因分別為5和3個(gè)；利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。見(jiàn)圖5。

圖5 RNA-Seq和qTR-PCR的8個(gè)差異基因表達(dá)水平Fig.5 Analysis of eight differential genes expression levels between RNA-Seq and qTR-PCR

3 討論

傳統(tǒng)觀念上，細(xì)菌是獨(dú)立游離的個(gè)體，然而有研究表明，只有不到0.1%的微生物種群處于游離生長(zhǎng)模式，大多數(shù)細(xì)菌以更復(fù)雜的生物被膜形式生存[14]。研究表明，細(xì)菌生物被膜可引起至少65%人類感染，以生物被膜形式存在的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物、外界環(huán)境壓力和宿主免疫系統(tǒng)的抵抗能力增強(qiáng)，生物被膜相關(guān)感染的治療是臨床的重大難題[15]。本研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序比較臨床CRAB生物被膜態(tài)細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌的差異，探究臨床CRAB生物被膜形成的機(jī)理。以往研究中，一般選取同1株菌作為樣本，且只設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)[8,10]。而生物學(xué)重復(fù)對(duì)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解讀和分析都非常重要，測(cè)序的樣本越多，越能夠降低背景差異，增強(qiáng)結(jié)果的可靠性[16]。本實(shí)驗(yàn)選取4株來(lái)源不同，但形態(tài)及理化特性相似、生物被膜形成能力強(qiáng)的臨床分離CRAB作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣本進(jìn)行測(cè)序，得到的測(cè)序數(shù)據(jù)更具可靠性。測(cè)序結(jié)果表明，與游離態(tài)菌相比，CRAB生物被膜菌中有212個(gè)DEGs上調(diào)、195個(gè)DEGs下調(diào)，這些差異基因主要涉及鐵、鎂、硫的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)、菌毛合成相關(guān)基因、生化代謝酶類、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、核酸及無(wú)機(jī)物質(zhì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因等。有文獻(xiàn)報(bào)道，鐵濃度與生物被膜的形成有關(guān)，在低濃度的鐵-Ⅲ的存在下，檢測(cè)到較高含量的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)信號(hào)分子酰基高絲氨酸內(nèi)酯[17]。鐵的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)等DEGs的變化證明細(xì)菌生物被膜的形成過(guò)程中需要鐵的參與。本研究中DEGsTonB依賴的鐵載體受體、亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及鐵螯合酶等顯著上調(diào)，表明生物被膜形成后，細(xì)菌對(duì)鐵的需求增強(qiáng)，鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取對(duì)生物被膜有重要影響。菌毛CsuA的表達(dá)上調(diào)，提示菌毛加速合成，促進(jìn)生物被膜的形成。關(guān)于生物被膜形成的耐藥機(jī)制，有一種觀點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)限制學(xué)說(shuō)，生物被膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)限制，細(xì)菌生長(zhǎng)速度變慢和代謝減緩，導(dǎo)致生物被膜態(tài)的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性降低[18-19]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中生化代謝酶類相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)驗(yàn)證了這個(gè)觀點(diǎn)。此外，也有一些未知基因(假設(shè)蛋白)在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較中出現(xiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)，這些基因在其中的作用還需進(jìn)一步探究。

對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集和KEGG富集，有助于進(jìn)一步探究在生物被膜形成過(guò)程中起作用的信號(hào)通路[20]。結(jié)果表明，硫代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)及苯甲酸酯降解等通路顯著富集。值得注意的是，DEGs也富集到雙組份系統(tǒng)、萬(wàn)古霉素耐藥、核苷酸切除修復(fù)、群體感應(yīng)、β-內(nèi)酰胺抗性及抗生素的生物合成這些通路中。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將ATP水解與各種底物的主動(dòng)運(yùn)輸結(jié)合在一起，有利于細(xì)菌耐藥性的轉(zhuǎn)移及生物被膜態(tài)細(xì)菌的物質(zhì)交流[21-22]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是已知的最大蛋白家族之一，并廣泛存在于細(xì)菌中，將ATP水解與各種底物(例如離子、糖、脂質(zhì)、固醇、肽、蛋白質(zhì)及藥物)的主動(dòng)運(yùn)輸結(jié)合在一起[23-24]。游離態(tài)細(xì)菌與生物被膜態(tài)細(xì)菌的區(qū)別可能涉及各種物質(zhì)參與的能量交換，以及物質(zhì)的合成與代謝。

萬(wàn)古霉素耐藥通路的變化提示生物被膜的形成增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的抵抗力。李帥[8]報(bào)道多重耐藥AB在生物被膜狀態(tài)下，相關(guān)耐藥基因上調(diào)，幫助細(xì)菌獲得更強(qiáng)的抗藥性。糖肽類抗生素萬(wàn)古霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)生過(guò)程中肽聚糖的合成，通過(guò)與五肽的D-Ala-D-Ala C末端結(jié)合而起作用，從而阻止亞基向肽聚糖骨架的添加[25]。與生物被膜態(tài)細(xì)菌相比，游離態(tài)細(xì)菌在萬(wàn)古霉素耐藥通路下調(diào)，可能表明生物被膜的形成增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性。陽(yáng)離子抗菌肽信號(hào)通路在宿主防御細(xì)菌感染中起著重要作用，并且是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分[26]。游離態(tài)與生物被膜態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)換過(guò)程中陽(yáng)離子抗菌肽耐藥通路發(fā)生了上調(diào)。群體感應(yīng)系統(tǒng)允許細(xì)菌感知細(xì)胞密度并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，群體感應(yīng)控制的過(guò)程包括細(xì)菌毒力、運(yùn)動(dòng)、孢子形成及生物被膜的形成等[27]。本研究中RNA伴侶蛋白、DNA結(jié)合應(yīng)答調(diào)節(jié)因子PmrA、雙組份傳感器組氨酸激酶等DEG富集到群體感應(yīng)信號(hào)通路中，表明生物被膜的形成與群體感應(yīng)密切相關(guān)。

綜上，本研究對(duì)臨床CRAB生物被膜態(tài)細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，獲得大量差異基因；這些DEGs富集到硫代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)及苯甲酸酯降解等通路中，初步揭示臨床CRAB曼不動(dòng)桿生物被膜形成的機(jī)理，為藥物作用靶點(diǎn)的研究及臨床抗感染治療提供一定的理論依據(jù)。