芪斛楂顆粒不同部位對小鼠巨噬細胞增殖和吞噬活性及細胞周期的影響*

黃甫靜，張金娟，馮敏，廖尚高，何迅

(1.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；3.葵花藥業集團貴州宏奇有限公司，貴州 六盤水 553400；4.貴州醫科大學 醫藥衛生管理學院，貴州 貴陽 550025)

芪斛楂顆粒是由黃芪、山藥、炙甘草、石斛、茯苓、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮及白術11味藥味組成的中藥復方制劑，臨床上用于脾失健運引起的易感冒、厭食及便溏等癥的治療，療效確切[1]。研究表明，脾虛與機體的免疫功能密切相關，免疫系統的運轉又與巨噬細胞的功能密切相關[3]，諸多關于脾虛證的研究將巨噬細胞作為了研究對象[2-4]。已有研究表明，組成芪斛楂顆粒制全方的11味藥均具有免疫調節方面的活性[4-14]，其中黃芪、甘草、茯苓、黨參及白術還可通過促進巨噬細胞增殖、增強其吞噬活性，從而發揮免疫調節作用[15-19]。芪斛楂顆粒組分眾多、成分復雜，其發揮作用的活性部位目前尚不清楚，探討其活性部位有利于提高該制劑的質量控制水平和進一步的應用推廣[20]。本研究按照極性差異將芪斛楂顆粒分成4個不同部位，以小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7為對象，考察芪斛楂顆粒不同部位對巨噬細胞的影響，為評價芪斛楂顆粒的免疫調節活性及活性部位奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞 小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要藥品和試劑 芪斛楂顆粒浸膏(葵花集團貴州宏奇有限公司)，磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液(PBS粉末自配，pH 7.2～7.4，質量濃度11.74 mg/L；無錫傲銳東源)，伯克改良伊格爾培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)和0.25%胰蛋白酶(美國Gibco)，胎牛血清(美國ScienCell)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，細胞培養級)，四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)及中性紅染料(北京索萊寶)，細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基)。

1.1.3主要儀器 SG8200HE型超聲波提取器(上海冠特)，TB-2150D型梅特勒-托利多十萬分之一天平(北京賽多利斯)，CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific)，酶標儀(美國Bio-Tek)，Primo Vert型倒置顯微鏡(成貫儀器)，SW-CJ-2D型超凈工作臺(蘇州凈化設備),NoveCyte流式細胞儀(美國艾森生物)。

1.2 研究方法

1.2.1芪斛楂顆粒不同部位的制備 取斛楂顆粒浸膏100 g，加水500 mL溶解，加95%乙醇使含醇量為80%，攪拌均勻，靜置12 h，抽濾、收集沉淀物，按savage試劑 ∶粗多糖溶液=1 ∶5加savage試劑，充分攪拌1 h，8 000 r/min離心 10 min，取上清液，棄濾渣，重復操作5～6次，取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后即得多糖，為A部位(fraction A，Fr.A)；在多糖樣品中濾出沉淀物(多糖)后，收集濾液，減壓濃縮得浸膏，冷凍干燥，得非多糖浸膏備用；濕法上大孔樹脂D101柱，以水、75%乙醇和95%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，分別得水洗脫部位(fraction B，Fr.B)、75%乙醇洗脫部位(fraction C，Fr.C)及95%乙醇洗脫部位(fraction D，Fr.D)。

1.2.2RAW264.7細胞的培養 RAW264.7細胞使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每24 h換液1次，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續試驗。

1.2.3芪斛楂顆粒不同部位對RAW264.7細胞增殖活性的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×108個/L的密度按100 μL/孔接種于96孔細胞培養板中，培養24 h；吸棄原培養基，加7.81、15.73、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00及1 000.00 mg/L芪斛楂顆粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D，空白組加不含藥物的完全培養基，每組設6個復孔；藥物作用24 h ，每孔分別避光加5%MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸盡孔中溶液，每孔加DMSO 150 μL搖床振蕩10 min。酶標儀上測定490 nm 波長處的吸光度(optical density，OD)，計算細胞增殖率[細胞增殖率(%)=OD處理組/OD空白組×100%]。

1.2.4芪斛楂顆粒Fr.A部位對RAW264.7細胞吞噬活性的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×108個/L密度按100 μL/孔接種于96孔細胞培養板，培養24 h，將RAW264.7細胞隨機分為空白組(不含藥物的完全培養基)、LPS組(5.00 mg/L)及Fr.A組[低(30.00 mg/L)、中(60.00 mg/L)及高劑量組(120.00 mg/L)]，按分組情況給藥，空白組給予等體積的完全培養基，每組設6個復孔；培養24 h，吸棄上清，每孔加中性紅試劑200 μL，培養2 h，PBS洗滌3遍，加乙酸-乙醇溶液(50%乙醇、1%乙酸及49%水，200 μL/孔)，常溫振搖15 min，于540 nm處測定OD值，并計算中性紅吞噬率[中性紅吞噬率(%)=OD處理組/OD空白組×100%]。

1.2.5芪斛楂顆粒Fr.A部位對RAW264.7細胞增殖周期的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×109個/L的密度按2 mL/孔接種于6孔細胞培養板，培養24 h，按“1.2.4”項下分組情況設置各試驗組，每組設3個復孔，培養24 h，預冷PBS洗滌1遍，0.25%胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，收集細胞；預冷PBS洗滌3遍，加預冷70%乙醇500 μL，4 ℃固定過夜，1 000 r/min 離心3 min；預冷的PBS洗滌3遍，棄上清，加PI/RNase(PI ∶RNase=9 ∶1)工作液500 μL，室內避光放置60 min，用流式細胞儀檢測各組細胞的周期變化，每組重復3次實驗，計算染色平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖活性

與空白組相比，質量濃度15.73～1 000.00 mg/L Fr.A和Fr.C組RAW264.7細胞的增殖率上升(P<0.05或P<0.01)，質量濃度500.00～1 000.00 mg/L Fr.B組RAW264.7細胞的增殖率明顯增加(P<0.01)，質量濃度7.81～1 000.00 mg/L Fr.D組RAW264.7細胞的增殖率無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

注：A～D分別為芪斛楂顆粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D部位；與空白組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖1 芪斛楂顆粒不同部位對RAW264.7細胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of different fractions of qihuzha granule on RAW264.7 cell proliferation

2.2 Fr.A部位對RAW264.7 細胞吞噬活性的影響

結果顯示，與空白組相比，LPS組RAW264.7細胞的中性紅吞噬率明顯上升(P<0.01)，低、中、高劑量Fr.A組RAW264.7細胞的中性紅吞噬率隨藥物質量濃度的增大而增加，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與空白組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 芪斛楂顆粒Fr.A部位對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.2 Effects of Fr.A of qihuzha granule on phagocytic activity of RAW264.7 cells

2.3 Fr.A部位對RAW264.7 細胞增殖周期的影響

結果顯示，與空白組比較，LPS組和中、高劑量Fr.A組RAW264.7細胞在G0/G1期的細胞比例上升、G2/M期的細胞比例降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，S期的細胞比例無變化(P>0.05)。見圖3。

注：A～E分別為空白組、LPS組、低劑量Fr.A組、中劑量Fr.A組及高劑量Fr.A組的流式細胞儀檢測結果，F為各組細胞周期定量結果；與空白組比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05。圖3 各組RAW264.7細胞的增殖周期Fig.3 Cell cycles of RAW264.7 cells in each group

3 討論

芪斛楂顆粒對小兒脾胃氣虛引起的相關臨床癥狀有良好的治療作用，“脾為之衛”，對機體免疫系統的維持被認為是脾臟的重要功能之一，脾虛時機體的免疫功能受到抑制[21]。在細胞層面表現為巨噬細胞的活性減弱、增殖受到抑制、吞噬功能顯著下降，自然殺傷細胞的活性降低，T細胞和B細胞等淋巴細胞的增殖活性受到抑制等方面的改變[22-23]。有研究認為，巨噬細胞的功能下降是脾虛證免疫功能失調的重要機制之一[24]。巨噬細胞是皮膚黏膜屏障之后抵抗病原微生物入侵的第一道防線，對天然免疫和獲得性免疫均有重要影響，在免疫系統中占據了重要地位[25]。研究表明，巨噬細胞的功能改變會導致機體的免疫穩態遭到破壞[26]；馬海航等[27]研究表明巨噬細胞的數量變化和活化與機體免疫功能改變密切相關。本研究考察了芪斛楂顆粒不同部位對巨噬細胞的影響，結果顯示，芪斛楂顆粒的Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均對RAW264.7細胞的增殖活性有促進作用，而Fr.D部位對該細胞的增殖無影響，提示芪斛楂顆粒中極性中等和極性偏大的成分能夠促進RAW264.7細胞增殖，小極性成分則不影響該細胞的增殖；在具有促進細胞增殖活性的3個部位中，Fr.A部位的作用最強，提示Fr.A為其主要活性部位，故而采用Fr.A部位進行后續研究。

巨噬細胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老細胞、殺滅外源性抗原及抗原提呈等的作用，是檢驗其細胞功能強弱的重要指標[28]。本研究的中性紅吞噬試驗結果顯示，Fr.A部位可以顯著提高RAW264.7細胞吞噬中性紅染料的的能力，對其吞噬活性具有良好的促進作用。

細胞周期是指細胞分裂結束到下一次分裂結束所經歷的過程，其基本流程為：G0/G1→S→G2→M，處于不同周期的細胞，其內部的DNA含量具有較大的差異[29]。對細胞周期進行檢測，可以反映出各周期階段的細胞比例，從而觀察藥物對細胞增殖的影響[30]。本研究結果顯示，Fr.A部位可以使處于G0/G1期的巨噬細胞比例增多，且其作用強度隨藥物質量濃度的加大而增強，提示Fr.A部位可通過增加處于分裂初期或具有分裂潛質階段的細胞比例而加速巨噬細胞的增殖。

綜上所述，本研究初步探討了芪斛楂顆粒不同極性部位對RAW264.7巨噬細胞的影響，發現芪斛楂顆粒中Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均能促進RAW264.7細胞增殖，其中Fr.A部位活性最強可增強RAW264.7細胞的吞噬活性，并增加處于G0/G1期的巨噬細胞比例，提示Fr.A部位可能是芪斛楂顆粒改善脾虛證相關癥狀的主要活性部位。