白蛋白紫杉醇與五氟尿嘧啶聯合用藥對人胃癌細胞增殖及周期的影響*

成興真，楊芳 ，王楊，聶微，劉澤瑩，王黔，嚴芝強**

(1.貴州醫科大學 外科學教研室,貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床血液教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學附屬醫院 胃腸外科，貴州 貴陽 550004)

白蛋白紫杉醇(albumin-bound paclitaxel,Nab-PTX)是一種新型無溶劑的紫杉醇(paclitaxel,PTX)納米制劑，具有微管抑制劑的作用，其抗腫瘤原理是通過促進微管蛋白聚合以及穩定微管導致腫瘤細胞停滯在 G2-M 期，最終導致有絲分裂細胞死亡[1-2]。目前Nab-PTX已廣泛用于乳腺癌、肺癌和胰腺癌等腫瘤的治療，但日本胃癌治療指南(最新版)指出 Nab-PTX可用于胃癌治療[3]，發現在可切除胃癌的圍手術期、腹膜轉移、進展期胃癌、不可切除及復發性胃癌等的治療中均表現出較好療效[4-7]，且國內將 Nab-PTX應用于胃癌治療的臨床報道也表明 Nab-PTX抗腫瘤效果良好[8-13]。五氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作為各大指南推薦的胃癌一線化療藥[3，14-15]，其作用機制為抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換為胸腺嘧啶核苷酸，從而發揮抗腫瘤作用[16]。目前關于Nab-PTX聯合5-Fu對胃癌細胞的研究較少，且尚無研究表明Nab-PTX聯合5-Fu對胃癌細胞周期的作用影響，因此本研究通過研究Nab-PTX聯合5-Fu對胃癌細胞(AGS)增殖及周期的影響，為胃癌用藥提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1細胞、試劑及藥物 胃癌細胞株AGS購于中國科學院細胞庫，RMPI 1640、PBS緩沖液、普通胰酶(含EDTA)及不含EDTA胰酶、胎牛血清均購于Biological Industries(BI，以色列)，Cell Counting Kit-8購于Dojindo Laboratories(日本)，流式細胞周期檢測試劑盒購自Becton,Dickinson and Company(BD，美國)，Nab-PTX購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，5-Fu購自天津金耀藥業有限公司。

1.1.2主要儀器 流式細胞儀Canto II plus (美國,Becton,Dickinson and Company)、酶標儀Varioskan LUX (美國,Thermo scientific)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 采用含10%胎牛血清的 RMPI 1640 完全培養基培養細胞株AGS，并置于含 5% CO2的濕潤空氣以及37 ℃的恒溫培養箱中培養；胰酶(含EDTA)消化處于對數生長期的細胞，用完全培養基重懸成細胞單懸液，進行傳代培養。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖情況 將處于對數生長期的AGS 細胞以 1×104/孔接種于96孔板中，每孔加入200 μL完全培養基。24 h后去除培養基，PBS洗滌3次并向Nab-PTX組加入 Nab-PTX(濃度梯度為0.1、0.2、0.4 μmol/L)，5-Fu組加入5-Fu(濃度梯度分別為1、2、4 μmol/L)，Nab-PTX+5-Fu組加入Nab-PTX+5-Fu[濃度梯度分別為(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]，各200 μL,將只含200 μL RMPI 1640培養基的對數生長的AGS細胞作為對照組(Ctrl組)，僅含200 μL RMPI 1640 培養基(不含AGS細胞)作為空白組。每組設置5個復孔，分別培養24 h、48 h、72 h后，去原培養液；用 PBS 洗滌3次，加入100 μL的 RPMI 1640 培養液、每個孔10 μL CCK-8 溶液,在 37 °C 含 5 % CO2孵箱孵育1.5 h，使用酶標儀在吸光度為 450 nm 波長處測量吸光度。實驗重復3次，計算細胞增殖存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3流式細胞術分析細胞周期 取 2×105個對數期的AGS細胞，接種于6孔板中,待生長至80%時,分別加入 Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu[(0.2+2)μmol/L]；培養細胞24 h，用預冷PBS洗滌3次，加入不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化，離心后收集細胞；收集細胞后加入 4 ℃ 預冷的70%乙醇固定24 h，1 000 r/min離心后去上清，使用預冷 PBS 洗滌細胞 3 次，后加入 500 μL Staining Buffer、25 μL PI、10 μL RNA 酶，避光 37 ℃ 水浴 30 min 后上機檢測，計算每組細胞所處G0/G1、S以及G2/M期的比例，評估每組細胞的周期阻滯情況，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖

培養72 h時,與Ctrl組比較，Nab-PTX組(0.4 μmol/L)、5-Fu組(2、4 μmol/L)及Nab-PTX+5-Fu組[(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]細胞存活率降低，差異有統計學意義(P<0.05)；結果顯示，與Ctrl組比較，同一時間點(培養72 h)不同濃度的Nab-PTX組、5-Fu組、Nab-PTX+5-Fu組細胞存活率增殖能力均受到抑制，且隨濃度增加，細胞增殖存活率下降。同一濃度[Nab-PTX組(0.2 μmol/L)、5-Fu組(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu組(0.2+2)μmol/L]不同作用時間，各組細胞的存活率隨著時間的延長而下降，其中培養24 h時的Nab-PTX組和Nab-PTX+5-Fu組，培養48 h 時的5-Fu組和Nab-PTX+5-Fu組，培養72 h 時的3組與對應時點的Ctrl組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu抑制AGS細胞的增殖具有劑量-時間依賴性，Nab-PTX+5-Fu組較Nab-PTX組、5-Fu組能更有效抑制AGS細胞的增殖。見圖1。

注：A為 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu不同濃度作用72 h對AGS細胞增殖能力的影響變化；B為Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(0.2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu(0.2+2 μmol/L)作用不同時間對AGS細胞增殖能力的影響變化；(1)與Ctrl組相比，P<0.05。圖1 各組AGS細胞抑制率(CCK-8)Fig.1 Cell inhibition rates of AGS in each group (CCK-8)

2.2 細胞周期

流式細胞術檢測細胞周期結果顯示：各組處理24 h后，與Ctrl組相比，5-Fu組G0/G1期比例明顯減少、S期比例明顯增加，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G2/M期比例明顯增加，組間對比差異具有統計學意義(P<0.05)；與Ctrl組相比，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G0/G1期比例明顯減少，Nab-PTX+5-Fu組S期比例明顯增加，5-Fu組G2/M期比例明顯減少，組間對比結果極具有統計學意義(P<0.01)。由此可見，Nab-PTX組使AGS細胞周期阻滯在G2/M期，5-Fu組使細胞周期阻滯于S期，Nab-PTX+5-Fu組使AGS細胞周期阻滯在S期，且Nab-PTX+5-Fu組S期比例較5-Fu組增加，G2/M期較Nab-PTX組明顯減少。見圖2。

3 討論

目前胃癌的物治療仍以化療或新輔助化療為主，當前各大指南推薦的化療藥物主要為5-Fu及其衍生物、鉑類、PTX及其衍生物等，而化療藥物的耐藥性成為胃癌有效治療的主要障礙[17]。實驗研究及臨床試驗表明Nab-PTX在胃癌治療中有明顯作用[7，18-19 ]，作為PTX制劑衍生物，Nab-PTX的抗腫瘤機制主要是誘導和促進微管蛋白聚合，抑制其解聚，進而有效抑制細胞有絲分裂過程中紡錘體及紡錘絲的形成，故導致腫瘤細胞發育在G2-M期受到阻滯和在有絲分裂時發生死亡，從而發揮抗腫瘤作用。與PTX相比，Nab-PTX的優勢在于不僅完全避免了激素脫敏處理，還改變了體內藥代動力學特征、提高了患者的耐受劑量，提高藥物在腫瘤組織中蓄積[20-21]。一項三期臨床試驗結果表明，Nab-PTX每周1次用藥的生存率不遜于PTX每周1次用藥的生存率,這種優勢使其成為胃癌二線治療的潛在方案[19]。

注：A為Ctrl組AGS細胞，B為Nab-PTX組AGS細胞，C為5-Fu組AGS細胞，D為Nab-PTX+5-Fu組AGS細胞，E為各組AGS細胞24 h結果統計圖；與Ctrl組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖2 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu作用24 h對AGS細胞周期的影響Fig.2 The effects of Nab-PTX,5-Fu ,and Nab-PTX+5-Fu treatment for 24 h on AGS cell cycle

有研究表明，從3例胃癌患者手術標本建立的人胃癌器官模型的研究中，Nab-PTX半數抑制率(IC50)明顯低于5-Fu及表柔比星，且隨著 Nab-PTX作用時間增加，腫瘤細胞的凋亡率明顯增加，Nab-PTX具有較強的抗腫瘤活性，可望成為治療GC患者的一線藥物[22]；研究還發現，Nab-PTX較5-Fu更能抑制腫瘤細胞增殖，且同樣表現出隨作用時間增加抑制率增加的現象。在本研究中發現，Nab-PTX聯合5-Fu作用于胃癌細胞，誘導細胞凋亡率高于 Nab-PTX、5-Fu單獨應用時；且有研究證實，在胰腺癌細胞中，吉西他濱和 Nab-PTX聯合作用，可增強兩種藥物的細胞毒性作用，從而降低其劑量，減少不良反應的發生[23]。由此推測，在將來胃癌的臨床治療中，Nab-PTX聯合5-Fu較 Nab-PTX或5-Fu單藥有更好的抗腫瘤作用。

眾所周知，細胞周期須經歷DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期),DNA合成后期(G2期)以及細胞有絲分裂期(M期)，這些過程又可以劃分為DNA復制與染色體分裂兩個部分，而在整個增殖過程中，有著嚴密精確的調控機制，如CDKs正向調節細胞周期，同時CDKs依賴cyclins,cyclinD與CDK4/6結合在G1期末期發揮作用，細胞由G1期過渡到S期則需cyclinE與CDK2結合[24]，CDK2與cyclinB結合將促使細胞從S期進入G2期，進入M期則需要cyclinA與CDK1結合。在細胞周期中，生長因子發揮著重要作用，但同時細胞周期也受到CKIs的反向調控作用，其發揮作用的機制主要是抑制CDKs與cyclins的結合。細胞周期的正常進行，需在CDKs、cyclins、CKIs共同協調下完成，其監控途徑又主要由在G1期向S期轉化起首要作用的pRb和DNA損傷檢查點上的p53發揮作用[25-27]。在胰腺癌細胞的研究中發現，Nab-PTX與吉西他濱聯用增強了細胞在S期的積累，由于在S期積累的細胞增加，導致G2期細胞的急劇減少[23]。同時通過對細胞周期信號蛋白的檢測，發現cyclinD1水平不受治療影響，而吉西他濱單獨或與 Nab-PTX聯合使用后，cyclinA2和cyclinE2水平升高。Nab-PTX聯合吉西他濱與吉西他濱單獨用藥相比，其cyclinB1的表達降低[23]。而cyclinB1參與S-G2細胞周期轉變[25]，由此也佐證了聯合用藥G2/M期細胞的減少。由此推測 Nab-PTX似乎干擾細胞S期的早期階段。本研究證實，Nab-PTX能將 AGS細胞株的細胞周期阻滯在G2/M期、5-Fu細胞周期阻滯發生在S期、Nab-PTX聯合5-Fu使細胞周期阻滯則發生在S期；相較于5-Fu單藥，Nab-PTX聯合5-Fu能使更多細胞阻滯于S期，由此推測Nab-PTX聯合5-Fu作用于胃癌細胞，一方面可能通過激活cyclinA2和cyclinE2表達 ，使細胞阻滯在S期；Nab-PTX還可加強5-Fu對DNA的損傷作用，激活p53抑制CDK2與cyclinB，Nab-PTX同時激活Rb，使細胞周期不能順利進入M期[27]。

綜上所述，Nab-PTX與5-Fu聯合用藥不僅能有效抑制細胞增殖，其抑制細胞增殖隨劑量及時間增加而增加，研究結果可為 Nab-PTX廣泛應用于胃癌治療提供數據參考，而 Nab-PTX與5-Fu聯合用藥使細胞周期阻滯在S期，但其潛在機制有待進一步探索。