鴨甲型肝炎病毒1型的鑒定及防治研究進(jìn)展

寧 揚(yáng)，陳曉雯，侯玉鳳，宋 翔，陳甜甜，謝全喜

（山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271000）

鴨病毒性肝炎（DVH）通常與肝壞死、出血和高病死率有關(guān)[1]，其特點(diǎn)是在鴨群中迅速傳播，患鴨突然死亡，剖檢可見肝臟腫大并伴有出血性病變。3周齡以下的雛鴨易感，不到1周齡的鴨群患病如不加以控制，病死率可達(dá)100%[2]。鴨甲型肝炎病毒（DHAV）屬鴨細(xì)小病毒科（picornaviridae），病毒基因組是1個(gè)線性、單鏈、正鏈RNA，長(zhǎng)度約為7.8 kb。通過系統(tǒng)發(fā)育分析及中和試驗(yàn)，將DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3[3-4]。DHAV-1是最典型和最廣泛的血清型[5]。最近的一項(xiàng)流行病學(xué)研究中報(bào)告1種新的DHAV-1亞型（DHAV-1a），不同于其他主要導(dǎo)致肝臟病變的DHAV亞型，其靶向器官為脾臟和胰腺[6]。據(jù)報(bào)道，在DHAV-1和DHAV-2之間未發(fā)現(xiàn)交叉中和，而DHAV-1和DHAV-3之間存在有限的交叉中和作用[3]。近年來，東亞地區(qū)不同DHAV混合感染的發(fā)生頻率越來越高[7]，提高了DVAH防治的難度。

1 臨床癥狀

DHAV是鴨病毒性肝炎的致病因子。感染DHAV的雛鴨特征是急性感染、高病死率、神經(jīng)癥狀、肝臟腫脹和出血[1]。持續(xù)性DHAV感染對(duì)幼鴨具有年齡依賴和劑量依賴的傾向[8]，在患病鴨的腎臟、脾臟和肝臟中可發(fā)現(xiàn)較高的DHAV病毒載量[9]。感染的典型特征是嗜睡、共濟(jì)失調(diào)、視神經(jīng)痛以及急性死亡，尸體病理剖檢時(shí)通常可見肝臟增大，伴有瘀斑和瘀斑出血[1]。

在自然發(fā)生的DHAV-1感染暴發(fā)中，小于3周齡的雛鴨易通過水平傳播感染DHAV-1，導(dǎo)致急性感染性肝炎[10]。然而，由于其先天免疫相對(duì)較強(qiáng)，感染DHAV-1的成年鴨并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀[10]。Zhang等[11]首次從鴨胚胎中分離出DHAV-1，發(fā)現(xiàn)DHAV-1可能從種鴨到雛鴨的垂直傳播。3周齡以下的雛鴨感染DHAV-1后，病死率甚至高達(dá)100%。病死鴨不僅肝臟病變伴有腫脹和出血[12]，過氧化損傷也非常嚴(yán)重[13]。Yugo等[1]在DHAV-1中發(fā)現(xiàn)1種新的DHAV-1亞型（DHAV-1a），其特征是胰腺變黃和出血，與之前報(bào)道的以感染雛鴨肝臟腫脹和出血為特征的DHAV明顯不同。

2 診斷方法

針對(duì)鴨病毒性肝炎的檢測(cè)方法很多，但這些方法均存在局限性，不適合臨床應(yīng)用。中和試驗(yàn)方法耗時(shí)費(fèi)力[14]；其他檢測(cè)方法，如反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）具有高靈敏度和特異性，但成本昂貴，需要特殊儀器[15]。近年來，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（I-ELISA）逐漸成為臨床診斷的常用方法，通過對(duì)病毒感染過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和抗體進(jìn)行血清分型進(jìn)行病毒識(shí)別[16]，能準(zhǔn)確、高效、特異地檢測(cè)DHAV。Meng等[17]研究出利用熒光染料法（SYBR-Green-I）實(shí)時(shí)RT-qPCR檢測(cè)的方法，同時(shí)檢測(cè)和鑒別DHAV-1和DHAV-3。Shen等[18]、Zhou等[19]分別建立了VP3-DHAV-1-ELISA方法和3A-DHAV-1-ELISA方法，二者均可檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3。Zhou等[19]以3A蛋 白 為 包 被 抗 原，建 立 了DHAV-1抗體的3A-ELISA檢測(cè)方法，變異系數(shù)小于10%，以DHAV-1的3A亞基為基礎(chǔ)的I-ELISA法與以DHAV-1全顆粒為基礎(chǔ)的I-ELISA法的一致性為92.7%。

3 鴨病毒性肝炎的防治

DHAV基因組總長(zhǎng)度約為7.7 kb，包括由基因組結(jié)合蛋白（genome-linked protein，VPg）共價(jià)連接的5′非翻譯區(qū)（UTR）以及開放閱讀框（ORF）[4]。一旦病毒RNA釋放到宿主細(xì)胞中，即成為翻譯和復(fù)制的模板，以組裝大量的后代病毒[20]。DHAV的全基因組結(jié)構(gòu)為VPg+5′UTR-[VP0-VP3-VP1/2A（2A1?2A2?2A3）-2B-2C/3A-3B-3C-3D]-3'UTR+Poly（A）[4]，含有4種結(jié)構(gòu)蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。VP2蛋白與VP1、VP3蛋白一同暴露在病毒離子表面，VP4蛋白則位于病毒離子內(nèi)部。VP2蛋白具有多個(gè)抗原表位，可在宿主細(xì)胞中觸發(fā)免疫反應(yīng)[21]。表達(dá)VP1蛋白的重組疫苗已在雛鴨身上進(jìn)行試驗(yàn)，具有良好的保護(hù)效果[22]。

雖然VP3的變異性低于VP1，但VP3的變異性可能導(dǎo)致同一物種的功能不同。例如，VP3的氨基酸側(cè)鏈暴露在病毒衣殼表面[23]，具有良好的免疫原性和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫[24]；在宿主細(xì)胞侵襲過程中參與病毒黏附，可與細(xì)胞表面受體結(jié)合。此外，VP3還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。Lai等[26]研究DHAV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP3對(duì)DHAV-1病毒吸附和凋亡的影響，探討VP3在病毒生命周期中的作用，發(fā)現(xiàn)VP3介導(dǎo)DHAV-1病毒吸附，但并不是參與此過程的唯一蛋白。

近來的調(diào)查中，極少有DHAV-1和DHAV-3混合感染的病 例[27]。Zou等[28]從DHAV-1與DHAV-3中獲得 含有衣殼蛋白VP1的鴨腸炎病毒重組體。Zhang等[29]從噬菌體展示肽庫中分離出與單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）具有高度親和力的新型肽1GLTWKLPPSM10，能夠特異性地阻斷McAb 4E6與DHAV-1、DHAV-3的結(jié)合，也可模擬DHAV-1和DHAV-3的抗原表位，能夠觸發(fā)對(duì)DHAV的有效免疫反應(yīng)，并抑制體內(nèi)病毒感染。

自噬途徑對(duì)清除外源性病原體方面具有重要意義。Ming等[30]發(fā)現(xiàn)，DHAV激活了Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶（PI3KC3），富集磷脂酰肌醇三磷酸（PI3P），誘導(dǎo)自噬體的發(fā)生，阻斷了自噬的整合途徑，最終抑制溶酶體與成熟自噬體的融合。

DHAV-1感染可引起鴨胚纖維細(xì)胞的自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是自噬激活的重要調(diào)控因子。Lan等[31]的研究數(shù)據(jù)為宿主細(xì)胞對(duì)DHAV-1的反應(yīng)提供了新的線索，并確定了參與DHAV-1感染過程或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬過程的蛋白質(zhì)。Ming等[32]發(fā)現(xiàn)，黨參多糖（CPPS）不具有調(diào)節(jié)自噬作用且對(duì)感染雛鴨無治療作用，但使用磷酸化黨參多糖（PCPPS）治療則降低了DHAV和西羅莫司激活的自噬體膜型的表達(dá)水平，表明抑制了自噬體的形成，進(jìn)而使DHAV基因組復(fù)制受到抑制。

中藥提取物在控制DHAV感染中作用較為明顯。Ming等[33]研究表明，野菊花多糖（CIPS）可在體外抑制DHAV基因組復(fù)制，并顯著降低病死率。Chen等[34]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷（BA）抗病毒作用較強(qiáng)，但溶解性較差，采用磷脂復(fù)合物對(duì)BA進(jìn)行修飾后制備了黃芩苷磷脂復(fù)合物（BAPC）。結(jié)果表明，BAPC在體外和體內(nèi)的抗DHAV-1能力均強(qiáng)于BA，其磷脂復(fù)合物能夠抑制DHAV-1的復(fù)制、吸附和釋放。

4 結(jié)論

鴨病毒性肝炎具有病死率高、傳播速度快的特點(diǎn)，病死率隨著發(fā)病日齡減小而升高。鴨群感染后主要發(fā)病部位為肝部。DHAV-1是我國當(dāng)前較為流行的鴨肝炎病毒，目前控制該病毒的主要措施是免疫接種。由于傳統(tǒng)疫苗未達(dá)到理想效果，研制有效的基因工程疫苗成為熱門研究方向。此外，中藥因結(jié)構(gòu)成分穩(wěn)定、毒副作用小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在對(duì)鴨病毒性肝炎的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。