某麋鹿保護區水源中細菌耐藥基因攜帶情況調查

邱 實，張含露，朱丹怡，呂 熙，萬春云，趙懿侔，楊豐利*，李鵬飛

（1．長江大學動物科學學院，湖北荊州434025；2．湖北石首麋鹿國家級自然保護區管理處，湖北石首434407）

隨著人類活動及現代化農業的發展，醫療行業和畜禽養殖業中抗生素的濫用情況使得抗生素成為環境中檢出頻率最高的新型環境污染物，抗生素環境污染問題已成為國內外環境衛生領域的研究熱點[1]。獸用抗生素被廣泛使用于治療和預防畜禽疾病，一些抗生素在動物體內吸收較差，可隨動物的排泄物進入環境中，加劇了耐藥菌的出現并增強了細菌的耐藥性[1]。隨著耐藥菌傳播速度加快，多重耐藥細菌增多已成為全球關注的問題[2]。目前對于抗生素耐藥基因的來源有2種推測：一是天然存在的耐藥基因，主要是由于某些微生物在產生抗生素的同時也具有相應的耐藥機制[3]；二是基因突變，由于抗生素的過量使用使細菌產生了選擇并促進耐藥基因的富集，讓許多原本不具備耐藥基因的細菌獲得了新的耐藥基因[4]。

本試驗以某麋鹿自然保護區水源內的細菌為研究對象，檢測四環素類、糖肽類、碳青霉烯類以及喹諾酮類耐藥基因的攜帶情況。研究旨在了解保護區水源中耐藥基因的攜帶情況，以期為后續探討保護區周邊地區耐藥基因的攜帶情況提供依據，同時為周邊地區抗生素的使用提供參考，降低耐藥菌及耐藥基因轉移的風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源

本試驗的水源樣本于2021年3月采自某麋鹿保護區內地表湖泊，設置14個采樣點，每個采樣點采集1份水樣。使用滅菌吸管吸取距水平面以下20 cm處的地表水源，每個采樣點采集10 mL水樣保存于滅菌EP管中，做好標記，編號1~14。

1.1.2 試劑與耗材

LB瓊脂、蛋白酶、細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；溶菌酶（合肥博美生物科技有限責任公司產品）；2×fast Pfu PCR Mix（北京佳蘭生物科技有限公司）；DL2000 DNA Marker（北京聚合美生物科技有限公司產品）；瓊脂糖（Biowest公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 收集菌體

分別吸取14份水源樣品100μL均勻涂布于LB瓊脂培養基中，37℃恒溫培養18~24 h，將培養出的菌落使用0.9%生理鹽水沖洗并收集于2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，吸凈上清收集菌體。

1.2.2 提取水樣細菌基因組DNA

提取水源樣本DNA，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的提取步驟進行。

1.2.3 耐藥基因引物的合成（見表1）

四環素類耐藥基因8種（tetA、tetC、tetL、tetM、tetO、tetW、tetB、tetX）[5-6]，糖肽類耐藥基因3種（VanA、VanB、VanC）[5]，碳青霉烯類耐藥基因5種（KPC、NDM、VIM、OXA-48、IPM）[7]，喹諾酮類耐藥基因3種（qnrB、qnrS、qepA）[5-6]。耐藥基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及條件見表1。引物4 000 r/min離心1 min，根據生物公司提供的參數，加入ddH2O配制成100 μmol/L的貯存液，并稀釋為10 μmol/L使用，分裝至EP管中－20℃保存，備用，避免反復凍融。

表1 耐藥基因引物序列Tab.1 Resistance genes primer sequences

1.2.4 PCR擴增耐藥基因序列

以單個耐藥基因為1組，配置14個PCR體系進行耐藥基因序列的擴增。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸20~60 s，共30~35個循環；72℃延伸10 min。

1.2.5 PCR產物凝膠電泳檢測

取3μL PCR擴增產物，進行1.0%瓊脂糖凝膠（耐藥基因tetA使用2%瓊脂糖凝膠）電泳檢測。電泳結束觀察結果，并拍照記錄。

2 結果與分析

某麋鹿保護區水源中細菌耐藥基因檢測結果見表2。由表2可知，共檢測到4種四環素類耐藥基因，其中耐藥基因tetA、tetB、tetO、tetX的檢出率分別為7.14%（1/14）、28.57%（4/14）、7.14%（1/14）和21.43%（3/14），未檢出耐藥基因tetC、tetL、tetM、tetW；檢測到1種糖肽類耐藥基因VanA檢出率為35.71%（5/14），未檢測到VanB、VanC；檢測到3種碳青霉烯類耐藥基因，其中耐藥基因NDM、KPC、VIM檢出率分別為35.71%（5/14）、14.28%（2/14）、14.28%（2/14），未檢測到耐藥基因OXA-48及IPM。未檢測到環丙沙星耐藥基因qnrB、qnrS、qepA。

表2 耐藥基因檢測結果Tab.2 Detection result of resistance genes

3 討論

Ji等[8]對上海地區的豬場、禽舍及養牛場內糞便樣品進行四環素類耐藥基因的檢測，檢測到tetB、tetM、tetO、tetW，與本試驗中耐藥基因的檢出情況略有差異。何良英[9]以及Tao等[10]分別對養殖場附近污水及廢水進行四環素耐藥基因檢測，前者發現tetA、tetO、tetW，未檢測到tetB；后者發現有tetA和tetW2種耐藥基因，結果均與本研究耐藥基因的檢出情況略有不同。張雪婧等[5]對甘肅地區某奶牛場土壤樣品耐藥基因的檢測項中，共有7種與本試驗重合的四環素耐藥基因（tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL、tetW），檢出的耐藥基因為tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL，檢出率為50%~100%，未檢測到耐藥基因tetX，與本試驗檢出情況存在差異。

VanA是最常見的耐藥基因，VanA型菌株對萬古霉素呈高水平耐藥[11]。張雪婧等[5]試驗中糖肽類耐藥基因VanB、VanC的檢出率均為100%，本試驗中未檢測到這2種耐藥基因。劉利強等[12]從鮮蛋表面分離出屎腸球菌并在5株耐萬古霉素的菌株中檢測到了VanA基因，檢出率為14.3%，低于本試驗檢出率。

細菌對于碳青霉烯類抗生素藥物產生耐藥性最主要的原因是產碳青霉烯酶水解了相應的抗生素。碳青霉烯酶最主要有5類[13]，分別為IPM、KPC、VIM、OXA-48和NDM，其中最為常見的是KPC。KPC是由blaKPC同位基因編碼的A類絲氨酸類酶[14]。2017年，張雪婧等[5]并未全部檢出NDM和KPC，但2018年時2種耐藥基因在2個牛場檢出率分別為53.55%、44.44%和27.27%、66.67%，表明耐藥基因有可能在不同地區之間進行水平傳播，耐藥基因型分布存在區域差異性。本試驗未檢測到OXA-48和IPM這2種基因型，可能是由于這2種基因型在國內屬于不常見的基因型[7]。水源中存在NDM、KPC和VIM等耐碳青霉烯類最常見的耐藥基因，可能是由于人類的干擾，存在進入保護區時帶入耐藥菌的可能[15]。

本試驗結果表明，該麋鹿保護區地表水源中攜帶有四環素類耐藥基因，檢出率為7.14%~28.57%；糖肽類耐藥基因，檢出率為35.71%；碳青霉烯類耐藥基因，檢出率為14.28%~35.71%。現有的耐藥基因的研究表明，不同地區和不同來源性的細菌耐藥基因的攜帶率存在差異性，且耐藥基因的檢出可能與檢測對象耐藥菌傳播機制有關。不同地區抗生素的使用情況不同，對應的不同地區耐藥性和耐藥基因的產生可能存在差異。一般使用抗生素較多的地區耐藥基因檢出率更高。本試驗中所檢測的4類抗生素耐藥基因相較畜禽養殖場等地區的耐藥基因的檢出率較低，采樣地區為麋鹿保護區，不存在對麋鹿針對性用藥的情況，故耐藥基因的檢出率較低。而該保護區仍能檢測到耐藥基因的情況與耐藥菌的遷移有關，其耐藥菌可能由周邊地區遷移而來。

4 結論

畜禽養殖過程中應減少抗生素藥物的使用，加強對麋鹿保護區周邊和長江中上游地區水源中耐藥細菌的定期監測以及對制藥廠、畜禽養殖場排放污水的監管，以降低耐藥菌在環境中轉移的潛在風險，并減少耐藥基因變異耐藥性增強的可能。