CRISPR-Cas9技術原理及其在豬的應用研究新進展

房元杰，張曉愛，魏文康*，劉春朋

（1．仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東廣州510225；2．廣東省農業科學院農業生物基因研究中心，廣東廣州510640）

基因編輯（gene editing，Ge）是能夠更準確地改變生物基因組內特定目標基因的新基因工程技術，指人為操作基因組的特定堿基插入、缺失或替換的行為，也被稱為基因組編輯。20世紀80年代，Thomas等[1]將外源DNA序列整合到哺乳類動物基因組的特定部位，成功修復堿基變異，并刪除DNA序列，由此開啟人工改變生物基因組的歷程。現在，基因編輯技術作為重要工具在生物醫學領域發揮著重要作用。

傳統的基因編輯技術依賴機體自發的同源重組修復機制，打靶效率低、操作煩瑣[2]，需要對隨機集成的基因組進行解決、置換或變更。因此，傳統的基因編輯技術無法滿足現階段的需求。集群規律間隔回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，Cas）的出現[3]彌補了傳統基因編輯技術的缺點。Cas蛋白家族中，Cas9蛋白因設計制造簡單、高速、高效、低成本等優勢，被快速和廣泛使用，成為科學研究和醫療等領域的有效工具。

豬是重要的農業經濟動物，CRISPR-Cas9技術在活體豬中的應用不僅有助于提高豬的生產和繁殖性能，還有利于編輯和改良豬品種。

1 CRISPR-Cas9技術發展歷程

1987年，科研工作者發現大腸桿菌基因組IAP基因有特殊的重復間隔序列存在。2000年，研究人員發現大多數古菌、細菌以及線粒體基因組中均有規則重復間隔序列，并命名為規則短回文間隔重復序列（short regularly spaced repeats）[4]。2年后，Jansen等[5]發現，原核生物基因組中有新的重復序列，根據該重復基因座家族的結構特性，將其命名為規律成簇的間隔短回文重復序列。Barangou等[6]在噬菌體試驗中，首次證實原核細胞的適應性免疫系統，并發現噬菌體DNA能被crisprRNA特異性斷裂。2012年，美國伯克利實驗室研究員Jenik等[7]把crRNA-tracrRNA復合物簡潔化，改造成嵌合體單鏈結構，即向導RNA（guide RNA，gRNA）。

2014年，Wu等[8]把CRISPR-Cas9技術應用在哺乳動物細胞上進行基因組結合，并純化CRISPR及CRISPR相關蛋白技術。2017年，Abudayyeh等[9]研究表明，Cas酶可特異性降低哺乳動物細胞中RNA水平。哈佛大學Vikram等[10]在動物細胞基因組編輯程序中對天然蛋白質Cas9進行修飾，獲得一種新的Cas酶Cas9。該酶是具有更高DNA特異性Cas9突變體。隨著基因編輯技術不斷完善，高效且高特異性Cas9蛋白變體的數量庫不斷增長，促使基因組編輯技術發展更加迅速。

2 CRISPR-Cas9技術原理及功能

2.1 CRISPR-Cas9技術原理（見圖1）

由圖1可知，CRISPR-Cas9編輯技術由內切酶靶向位點切割生物基因組使DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。DSB在細胞內的修復方式為同源重組（homologous recombination）和非同源末端連接（nonhomologous end joining）。其中，非同源末端連接的修復機制主要發生于真核生物[11]，通過核苷酸的插入或缺失，不需要同源序列即可重新連接DNA游離末端，進而實現基因敲除的目的[12]。當同源序列存在時，DSB區間大概率發生同源重組，進而定點敲入或編輯基因[13]。

2.2 CRISPR-Cas9系統功能

CRISPR-Cas系統存在于絕大多數古生菌和近半細菌中，對外源性病毒和質粒入侵有著天然的免疫防御機制[14]。目前，CRISPR-Cas系統應用最為廣泛的是來自產膿鏈球菌的Ⅱ型系統，即CRISPR-Cas9系統。該系統的構成為重復序列和間隔序列；重復序列高度保守，上游有前導序列（leader sequence），前導序列引導集群間隔短回文序列轉錄成非編碼CRISPR RNA（crRNA），crRNA與反式激活RNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）結合形成復合物。CRISPR-Cas9系統工作原理（見圖2）。

CRISPR-Cas9系統由CRISPR序列和Cas9基因構成，CRISPR序列又包括前導序列、重復序列和間隔區。由圖2可知，該系統主要概括為3個過程，分別為適應、表達和干擾[15]。外源物質入侵機體時，外源物質顆粒的小段脫氧核糖核苷酸序列會整合到宿主基因組的前導序列和重復序列之間，跟隨宿主DNA復制，生成新結構[6]。在表達過程中，首先把CRISPR基因組轉錄成一段長鏈RNA，即CRISPR RNA前體；Cas蛋白則生成復合物，該復合物執行內切酶的功能，將crRNA特異性切割并加工成成熟的crRNA；加工后的crRNA和Cas蛋白結合形成復合體，在干擾過程中發揮其功能[4]。當外源物質顆粒再次接觸宿主時，crRNA與同源外源核酸序列自然結合，復合體將外源核酸切割成碎片，保護宿主免受侵害[6]。

3 CRISPR-Cas9技術的應用

3.1 CRISPR-Cas9技術在育肥豬生產中的應用

育肥豬自然狀態下生長緩慢、瘦肉率低，難以達到要求，可采用基因編輯技術修飾生長相關基因來改變當前狀態。

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是一種抑制肌細胞生長的蛋白，由動物肌細胞天然產生。MSTN不僅能夠抑制骨骼肌細胞的增殖和分化，還能夠決定肌肉纖維的數量，是影響肌肉生長和瘦肉率的主要代謝抑制因子。車東升等[16]利用CRISPR-Cas9技術在豬胚胎成纖維細胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs）中誘導非同源末端連接，通過體細胞核移植技術和胚胎移植技術獲得MSTN突變仔豬。結果表明，雙心MSTN基因豬骨骼肌纖維越多、瘦肉率越高。

可選擇標記基因（selectable marker gene，SMG）是動物體內源基因，該基因可能干擾引入基因的正常表達，并使宿主對抗生素產生耐藥性，對整體性能產生不利影響。2016年，Bi等[17]利用CRISPR-Cas9和Cre-LoxP重組方法，敲除豬原代細胞中MSTN的特定等位基因KO，并使用Cre重組酶從等位基因KO中刪除SMG，并制備無標簽MSTN基因克隆豬。western-blot檢測結果發現，基因克隆豬MSTN蛋白表達量大幅下降，肌肉中相關基因表達效果顯著增強。

2017年，Zheng等[18]采用CRISPR-Cas9介導非同源重組整合外源片段，利用SCNT和ET技術構建KI基因特異性編碼解偶蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）修飾豬，使UCP1小鼠基因在白豬脂肪組織中特異性表達。研究結果表明，UCP1基因能降低脂肪合成、提高瘦肉率。KI-UCP1突變豬具有胴體率高、脂肪沉積少的優點，生產含KIUCP1基因的突變豬能夠改善熱調節、增強仔豬在寒冷環境中產熱能力，提高仔豬存活率，降低低溫對生豬生產造成的經濟損失，為人類提供健康優質的豬肉及其副產品。

3.2 CRISPR-Cas9技術在抗豬繁殖與呼吸綜合征中的應用

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and repiratory syndrome virus，PRRSV）引起的只感染豬并引起母豬妊娠流產，仔豬和育肥豬肺炎的急性傳染病。2007年，Jay等[19]研究表明，CD163基因是PRRSV的細胞融合受體。PRRSV入侵細胞的關鍵結構域為SRCR5，由PRRSV的第7個外顯子編碼組成。為進一步研究CD163基因結構功能，韓曉松等[20]針對豬CD163基因第6和第7個內含子分別設計成對sgRNA，構建sgRNA成對表達載體；敲除CD163基因關鍵結構域SRCR5序列，構建SRCR5刪除的大白豬胎兒成纖維細胞；利用體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術成功制備了CD163 SRCR5缺失突變豬，為后續研究豬抵抗PRRSV奠定基礎。2017年，Christine等[21]研究發現，CD163 SRCR5缺失依然能在巨噬細胞表面正確表達，表明SRCR5能清除血紅蛋白-結合珠蛋白的特性。為驗證SRCR5缺失豬巨噬細胞對PRRSV的感染情況，該團隊制備敲除CD163 SRCR5基因修飾豬，刪除CD163第7個外顯子，得到特定編輯質粒轉染PK-15細胞，顯微注射至豬受精卵胞質，獲得外顯子7缺失仔豬。結果顯示，CD163 SRCR5刪除編輯豬能完全抵抗PRRSV，并保留該基因的生物學功能。2019年，Guo等[22]制備出敲除SRCR5中LBP（Ligand-binding pocket，LBP）的基因修飾豬。

3.3 CRISPR-Cas9在抗豬傳染性胃腸炎上的應用

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起仔豬嘔吐、脫水為特征的高度傳染性疾病。2019年，Luo等[23]采用CRISPR-Cas9技術破壞豬傳染性胃腸炎病毒中的一個假定受體氨基肽酶-N（APN），成功獲得了APN基因失活豬。后續試驗研究結果顯示，APN失活豬能正常存活和繁殖，新生仔豬對高致病性傳染性胃腸炎病毒有抗藥性；經過組織病理學分析發現，腸道中的胃腸炎病毒未引起APN失活豬腸道病變，但野生型仔豬小腸出現典型病變；免疫化學分析表明APN失活豬腸道組織中未發現傳染性胃腸炎病毒抗原。經過病毒感染試驗測試證明，APN失活豬能有效抵抗TGEV。

3.4 CRISPR-Cas9在抗非洲豬瘟中的應用

非洲豬瘟（African swine fever，ASF），一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的烈性傳染病。自該病暴發以來，國內養豬業遭受巨大的經濟損失。2018年，科研人員通過轉染編碼Cas9質粒和sgRNA引導非洲豬瘟病毒CP204L基因密碼子71向78改性，并以此得到野豬肺（WSL）細胞系，發現靶向Cas9能使病毒基因組裂解，并降低病毒量[24]。同年，Borca等[25]以豬巨噬細胞作為細胞基質，從高致病性毒株Georgia07基因中敲除非必需基因8-DR，獲得重組病毒，為將來疫苗研發奠定基礎。

3.5 CRISPR-Cas9技術在器官移植上的應用

異種移植間的超免疫排斥主要難題是α-GAL和non-GAL抗原，它們負責調節機體體液超敏反應。2014年，Li等[26]通過敲除豬體內與免疫排斥反應相關、在人體中已自然消失的基因，減輕異種器官移植帶來的排斥反應。同年，Masahiro等[27]破壞豬A-1，3-半乳糖轉移酶基因（GGTA1），使α-GAL表位合成受阻，降低了超急性排斥反應的發生概率。Chuang等[28]在敲除GGTA1基因的小型豬進行相關基因編輯得到3種突變豬biallelic mutant pig（bMt）、monoallelic mutant pig（mMt）、non-mutant pig（nMt）。該團隊研究人員對3種突變豬外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）細胞毒性測定，發現bMt pig的PBMC存活率最高，達到80%，PBMC存活率越高，超免疫排斥反應越小。2017年，高景波[29]對GGTAL1敲除的巴馬小型豬再破壞豬β1，4N-乙酰半乳糖胺轉移酶基因（β1，4N-acetylgalactosaminyl transferase，β1，4NGalNT2）,該基因編碼的蛋白能夠引起異種移植排斥反應，減少因異種移植排斥反應帶來的影響。

異種移植除受免疫排斥反應的干擾，豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retroviruses，PERV）的難題亟須解決。2015年，Yang等[30]使用CRISPR-Cas9技術整合Cas9編輯酶到豬基因組中誘導豬內源性逆轉錄病毒逆轉錄酶基因突變，抑制PERV復制。2017年，Niu等[31]敲除豬體內所有PERV基因，使得豬內源性逆轉錄病毒傳播的風險降低。同年，Yang等[30]與云南農業大學魏紅江教授合作研究顯示，豬細胞中的PERV能夠感染人細胞并傳染體外的人體細胞。為清除異種器官移植過程中內源性病毒跨種傳染的風險，研究人員采用CRISPR-Cas9技術結合細胞凋亡相關抑制劑、生長因子制備出PERV滅活的原發性豬細胞系、胚胎以及活豬。PERV滅活豬能夠提供更安全、有效的器官，以解決器官供應短缺的問題[30]。有研究人員采用crispr-cas9技術刪除豬胚胎中關鍵器官形成基因，創造遺傳“空位”，并將人誘導性多潛能干細胞（human induced pluripotent stem cell，HIPSC）注射至豬胚胎中，成功培養出含人體細胞的豬胚胎。張玄等[32]研究敲除PERV，同時敲除3種主要異種抗原并敲入9種人源化基因，獲得腎臟、肝臟、心臟，建立豬-猴異種器官臨床研究模型，結果表明，豬在克服超急性排斥反應、緩解體液排斥反應以及凝血紊亂上比較有優勢，但能否作為臨床異種器官移植供需體仍有待進一步研究。

4 展望

CRISPR和CRISPR相關蛋白技術，自2013年首次被應用于乳腺細胞，在短時間內得到較快發展，推動生物醫學領域大量研究，已成為當今世界上應用最廣泛的基因編輯技術。與傳統的選擇性技術相比，CRISPR-Cas9技術優勢明顯，可對特定基因進行編輯操作，短時間內即可獲得目的基因。CRISPR-Cas9技術可提高豬的生產性能，縮短繁殖周期，帶來良好的經濟效益。由于控制活豬的基因多且復雜，想通過改變特定的基因序列使它們的表型顯著體現仍有困難。近年來，養豬業遭受各種豬病的沖擊，CRISPR-Cas9技術能夠更好地了解分析病毒，對各類疾病的防控具有重要作用。CRISPR-Cas9技術促進了對動物的生命活動規律、重大疾病的發生和發展的了解，為器官移植提供理論參考和技術保障。隨著CIRSPR-Cas9技術的不斷完善和發展，該技術在豬基因組編輯中的應用對生物科學界具有更多的價值與意義。