豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗的免疫效力研究

李少麗，尹忠良，張春陽，斯琴高娃，康 斌，王家福

（杭州佑本動物疫苗有限公司，浙江杭州310018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱“豬藍耳病”，是以繁殖障礙和呼吸系統癥狀為特征的1種急性、高度傳染性的病毒性傳染病。該病可引起妊娠母豬流產、早產、產死胎、產弱仔豬以及仔豬和生長育肥豬的呼吸困難、生長緩慢、高病死率[1]。該病的病原體，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是1種正鏈小RNA病毒，屬于動脈炎病毒科，直徑50~65 nm，為1種有囊膜的病毒。PRRSV可分為美洲型和歐洲型2個基因型，我國分離到的基本為美洲型。

1996年，我國首次分離到PRRSV，命名為CH-1a[2]。2006年，我國多個省份的豬場出現由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的豬繁殖與呼吸綜合征疫情，商品豬病死率超過50%，母豬病死率高達5%以上，造成100多萬頭豬死亡[3]。后續研究表明，在HP-PRRSV的Nsp2區有30個不連續氨基酸的缺失[4]。2012年，我國又出現新的與美國NADC30基因同源性較高的PRRSV毒株，命名為類NAD30。感染該毒株的母豬群流產率高達10%~50%，仔豬厭食、嗜睡、被毛粗亂、生長緩慢，耐過豬多數成為僵豬，給我國豬場帶來巨大的經濟損失[5-7]。通過對全國各地分離出的PRRSV變異株進行Nsp2基因序列的比較分析，結果顯示，其Nsp2基因上均存在131個氨基酸的不連續缺失[8]。

近幾年，類NAD30毒株感染呈現增高趨勢，且與HP-PRRSV成為我國豬群藍耳病的兩大主要病毒類型[9-10]。PRRSV易變異及重組的特性導致疫苗毒力返強現象頻發，尤其是類NAD30易與疫苗毒及田間野毒發生重組。當前很多豬場存在PRRSV田間野毒株、疫苗毒株以及田間野毒株與疫苗毒的重組毒株等現象，PRRSV種類呈現多樣化[11-12]。研究人員陸續從發病豬場分離到PRRS疫苗毒與野毒重組的毒株，開始擔心PRRS弱毒疫苗安全性[13]。然而，類NAD30與目前流行的PRRSV疫苗株之間的基因組相似性只有85.5%~89.5%，導致商業疫苗對當前流行的類NAD30交叉保護較弱，免疫經典或HP-PRRSV疫苗的豬場均發生類NAD30毒株感染的現象，提示現有的商業化PRRS疫苗不能對豬產生足夠的免疫保護。

因此，應該開發與PRRSV流行毒株同源性更高且安全性更好的滅活疫苗，與PRRS活疫苗聯合使用，降低豬群發病率，保持生產成績的穩定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PRRSV ZJ/H（HP-PRRSV）和ZJ/NB（類NAD30）毒株、Marc145細胞、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）以及豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（CH-1a株）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗的制備

對制備的PRRSV抗原液BEI滅活，與水包油佐劑按3∶1乳化，制備PRRS二價滅活疫苗（ZJ/H株和ZJ/NB株），進行安全檢驗和免疫效力研究。

1.2.1.1 制苗用病毒液的制備

取生長良好的單層Marc145細胞，棄掉舊培養液，按5%比例（V/V）分別接種PRRSV ZJ/H株和ZJ/NB株毒種，37℃、5%CO2培養箱內吸附1 h后，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續培養。待80%細胞出現聚堆、脫落時收獲病毒液，凍融2次，-70℃保存。

1.2.1.2 病毒抗原液半數感染量（TCID50）的測定

將抗原液使用無血清DMEM做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63個稀釋度，分別接種于96孔板中的單層Marc145細胞，每個稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔，各孔補加0.1 mL的含2%胎牛血清的DMEM維持液，在37℃、5%CO2培養箱觀察5 d，按照Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.1.3 疫苗用病毒液的滅活

將檢驗合格的病毒液分別加入終濃度為5 mmol/L的BEI滅活劑，37℃攪拌滅活24 h，加入5 mmol/L的硫代硫酸鈉中和1 h，2~8℃保存。

滅活后，從每瓶病毒液中取樣，10倍稀釋后接種于已長成單層的Marc145細胞，每個樣品接種4瓶，每瓶1 mL，加維持液培養，盲傳2代，應無細胞病變出現。

1.2.1.4 乳化

將滅活后的2種病毒抗原按1∶1的體積比混合，按照病毒水相抗原與佐劑以質量比3∶1緩慢加入水包油佐劑，1 000 r/min攪拌20 min制成乳化劑。

1.2.2 豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗的安全試驗

選擇5月齡健康易感后備母豬5頭（中和抗體效價小于1∶4），每頭于頸部肌肉注射疫苗4 mL，觀察14 d，記錄臨床癥狀。

1.2.3 豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗免疫效力試驗（見表1）

表1 試驗設計Tab.1 Test design

40頭5月齡PRRSV抗原、抗體陰性的健康后備母豬（中和抗體效價小于1∶4）分為A~H 8個組。

A~F組先免疫商品化高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株），2 mL/頭份。2 w后，C、D組免疫制備的豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗（ZJ/H株+ZJ/NB株），E、F組免疫商品化豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗（CH-1a株）；A、B、G及H組免疫PBS，2 mL/頭。

二免14 d后，所有試驗豬按照試驗分組情況使用ZJ/H株或ZJ/NB株攻毒（105.0 TCID50），每頭滴鼻1 mL，于頸部肌肉注射2 mL，連續觀察14 d后，所有存活豬安樂死。

根據試驗豬的臨床癥狀、中和抗體水平、攻毒前及攻毒后7、14 d的血清病毒載量和體重變化等，評價所制備豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗對后備母豬的免疫效力。

2 結果與分析

2.1 PRRSV ZJ/H和ZJ/NB株病毒抗原液含量測定

ZJ/H株和ZJ/NB株PRRSV病毒含量均不低于107.0TCID50/mL。

2.2 制苗用抗原液的滅活及檢驗

2種滅活后的PRRSV抗原液接種Marc145細胞盲傳2代，均未出現細胞病變，表明滅活完全。物理性狀檢驗等符合新版《中國獸藥典》要求。

2.3 安全性試驗結果

5頭試驗豬每頭頸部肌肉注射疫苗4 mL，觀察14 d，期間精神、食欲正常，未出現任何不良反應，接種部位未出現紅腫現象，表明疫苗具有良好的安全性。

2.4 免疫效力試驗結果

2.4.1 免疫及攻毒后的臨床表現

A~F 6個組在疫苗免疫后精神、食欲均正常，無體溫升高等不良反應。攻毒后，A~F 6個組豬全部存活，其中B、E、F組各有1頭試驗豬發病，發病豬體溫升高，精神食欲下降，有咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀。G和H兩個不免疫攻毒對照組豬全部發病，分別有2頭和1頭死亡。結果表明，PRRS活疫苗雖對ZJ/H免疫保護較好，但對ZJ/NB的攻擊保護效率降低。若在PRRS活苗免疫后進行PRRS二價滅活疫苗的加強免疫，攻毒后未出現任何肉眼可見病變，提示對豬提供良好的攻毒保護。

2.4.2 免疫及攻毒后中和抗體檢測結果（見圖1）

由圖1可知，免后21 d所有組中和抗體均為陰性（小于1∶4），相比之下，C、D、E、F 4個滅活疫苗加強免疫組雖在首次免疫28 d后中和抗體仍較低，但在攻毒后第7 d中和抗體明顯上升，其中最高的C組中和抗體效價達4.9 log2；攻毒后第14 d滅活疫苗加強免疫組中和抗體水平略有下降，仍明顯高于其他試驗組；F組疫苗毒株誘導血清對HZ/NB的中和能力差，所以與其他3個滅活疫苗加強免疫組相比，中和抗體效價偏低。

2.4.3 免疫及攻毒后血清病毒載量檢測結果（見圖2）

由圖2可知，整個攻毒期間，C、D、E組均未檢測到PRRSV，A、B、F組攻毒后血清病毒載量較低，約為101.3~102.2 copies/μL；G組和H組病毒載量較高，達到103.4 copies/μL以上。研究表明，與單獨免疫PRRS活疫苗相比，PRRS滅活疫苗的加強免疫，尤其是免疫的同源性更高的PRRS二價滅活疫苗，可加速試驗豬體內排毒、縮短排毒期、有效降低病毒在自然感染后環境中的病毒量。

2.4.4 免疫及攻毒后各組日增重變化（見圖3）

由圖3可知，攻毒后7 d所有免疫組試驗豬的日增重均低于攻毒當天，其中C、D、E加強免疫組日增重降低不明顯（小于15 g），A、B兩組平均降低約167 g，G組和H組體重呈負增長。攻毒14 d后，A、B組試驗豬日增重逐漸恢復正常，C、D、E及F組基本恢復至正常生長水平，而G、H兩組存活試驗豬仍未實現增重。研究表明，滅活疫苗的加強免疫對提高豬的日增重、縮短出欄天數提供保障。

3 討論

本試驗利用PRRSV ZJ/H株和ZH/NB毒株制備豬繁殖與呼吸綜合征二價滅活疫苗，對所制備疫苗進行安全檢驗和效力免疫研究。結果表明，PRRS活疫苗與滅活疫苗的聯合免疫，可產生比單獨用PRRS活疫苗更高的中和抗體、更低的血清病毒載量并顯著提高日增重。PRRS活疫苗與制備的PRRS二價滅活疫苗的聯合免疫效果優于商品化的PRRS滅活疫苗（CH-1a株），單獨使用PRRS活疫苗的免疫豬仍出現PRRS相關癥狀，表明與攻毒毒株同源性更高的毒株制備的疫苗具有更強的免疫保護效果。田間應用也表明，類NAD30易與PRRS活疫苗毒株或野毒株重組，導致豬場中PRRSV病毒類型多樣化、豬病愈發復雜，應謹慎使用。PRRSV滅活疫苗安全性好，可提高免疫豬血清中和抗體效價[14]，應根據實際情況聯合應用PRRSV活疫苗及滅活疫苗防控豬藍耳病。

疫苗的免疫壓力也是誘導PRRSV發生變異的重要原因[15]，要科學運用PRRS疫苗，配合良好的飼養管理及生物安全防控，以逐步實現豬場藍耳病的免疫和無疫，最終達到凈化的目標。

4 結論

本研究結果表明，PRRS滅活疫苗的加強免疫，尤其與同源性更高的PRRS二價滅活疫苗聯合免疫，可加速試驗豬體內排毒、提高豬的日增重。