新城疫病毒山西分離株的分離鑒定及毒力分析

劉華棟，李婷婷，唐 娟，丁樹榮，陸冰洋，王彩先

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太原030032）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）感染引起的一種傳染性疾病，以高發(fā)病率和高病死率為特征，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。因疫苗的研制及應(yīng)用，新城疫的流行和傳播受到控制。但NDV也通過不斷地變異，使得疫苗的保護(hù)力不足，導(dǎo)致雞群發(fā)病率有所升高[1]。

NDV基因組可編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是NP核蛋白、F融合蛋白、M基質(zhì)蛋白、P磷蛋白、HN血凝素-神經(jīng)氨酸酶和L聚合酶，其中F融合蛋白與NDV的致病性和免疫應(yīng)答過程具有相關(guān)性，在其中起重要作用[2]。本研究從山西省不同養(yǎng)殖場分離鑒定了4株病毒，對其F基因序列進(jìn)行研究，確定分離到的病毒均為基因Ⅱ型弱毒株，并進(jìn)行了生物學(xué)毒力測定和動物回歸試驗(yàn)。以期確定山西地區(qū)當(dāng)前NDV流行毒株的基因型以及毒力強(qiáng)弱，為本病的防控和病原的凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料采集于山西地區(qū)不同養(yǎng)殖場。采用滅菌生理鹽水將棉簽浸濕，在發(fā)病雞的喉頭和泄殖腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)輕觸，將得到的咽肛拭子置于1.5 mL滅菌離心管，加入含有50%甘油的生理鹽水，標(biāo)記，保存。無菌取病死雞的肝、脾、肺等器官，置于一次性封口袋中并標(biāo)記，－20℃保存。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、RNA提取試劑盒，均購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（BS249）、6×DNA Loading Dye、Marker、DreamTaq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（SK1131）、蔗糖、瓊脂糖、瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂、阿氏液，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司；SPF蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；鮮血瓊脂培養(yǎng)基購自青島日水科技有限公司。

引物序列合成和PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)動物

1日齡、2周齡、60日齡的雛雞，均由SPF蛋孵化，飼養(yǎng)于試驗(yàn)動物房。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 PCR鑒定

取少許肺、肝、脾等組織混合，稱取1 g，剪碎后混勻，取0.05 g進(jìn)行無菌研磨，邊加入生理鹽水1.5 mL，繼續(xù)研磨成勻漿后轉(zhuǎn)至新的1.5 mL滅菌離心管中8 000 r/min離心2 min，離心完成后取100μL上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL滅菌離心管中。采用新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒提取病毒RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR采用的擴(kuò)增體系為：1.2μL酶混合液、2μL RNA模板、16.8μL RT-PCR反應(yīng)液，總體積為20μL。

PCR擴(kuò) 增 程 序 為：42℃、45 min；94℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，以上步驟循環(huán)35次；72℃終延伸7 min，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.4.2 病毒分離培養(yǎng)

無菌取發(fā)病雞和病死雞體內(nèi)肝臟、脾臟、肺臟等組織，3次凍融后加入PBS溶液研磨，置于4℃低溫經(jīng)10 000 r/min離心15 min后取上清，將其轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管中，加入雙抗（青霉素10 000 IU/mL、鏈霉素10 g/L），37℃感作作用1 h；使用0.22 μm濾膜過濾，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每枚蛋接種0.2 mL濾液。

蛋保存于孵化箱內(nèi)，每隔6 h照蛋1次，將24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去，死亡雞胚4℃保存過夜；雞胚尿囊液收集到無菌器皿，觀察死亡雞胚情況。采用血凝試驗(yàn)檢測尿囊液中有無凝集現(xiàn)象。1.4.3F基因擴(kuò)增

1.4.3.1 引物設(shè)計(jì)

F基因序列參照NCBI上已發(fā)表的序列，應(yīng)用Primer Premier設(shè)計(jì)引物，可擴(kuò)增F基因中位于94~457之間的區(qū)段，長度為363 bp。

序列為F-F：5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'；FR：5'-GGAGGATGTTGGCAGCAT-3'。

1.4.3.2 RNA提取參照RNA提取試劑盒說明書從1.4.2中收獲的雞胚尿囊液中提取新城疫病毒RAN。

1.4.3.3 反轉(zhuǎn)錄

參照M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書，將提取的新城疫RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（總體積為20μL）：RNA溶液10μL、Prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL、RT Primer Mix 1μL、5×Prime Script Buffer 4μL、RNase Free dH2O 4μL。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：37℃、15 min；85℃、5 s；完成后置于4℃保存。

1.4.3.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系（總體積為100 μL）：10×DreamTaq Buffer 10 μL、dNTP（10 mmol/L）6 μL、Template 20 μL、Taq酶（5 U/μL）0.5 μL、Mgcl26 μL、上下游引物各2 μL（25μmol/L）、超純水加至100μL，進(jìn)行RCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，以上步驟循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，切取目的片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，按照回收試劑盒說明書操作。

1.4.4 序列分析

使用軟件DNAStar，DNAMAN將測序的F基因的序列片段與GenBank中發(fā)表的NDV參考毒株相應(yīng)片段序列進(jìn)行氨基酸序列比對、同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。

1.4.5 生物學(xué)毒力測定

對4株NDV分離株進(jìn)行毒力測定，檢測平均雞胚致死時(shí)間（MDT）、靜脈致病指數(shù)（IVPI）、腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）等3個(gè)指數(shù)。參照OIE標(biāo)準(zhǔn)[3]方法進(jìn)行操作。

1.4.6 動物回歸試驗(yàn)

取25只15日齡非免疫雛雞，應(yīng)用HI方法采血測定ND抗體。取結(jié)果為陰性的雛雞作為試驗(yàn)組采用滴鼻點(diǎn)眼的方式滴入第三代雞胚尿囊液，對照組滴入滅菌生理鹽水，0.1 mL/只。8只雛雞分別滴入4株病毒的雞胚尿囊液，2只雛雞滴入生理鹽水作為對照。經(jīng)過2 w的隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄試驗(yàn)選用雛雞的發(fā)病情況，從發(fā)病雞體內(nèi)分離病毒并進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，4份病料均擴(kuò)增362 bp的條帶。

2.2 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

24 h后死亡的雞胚及96 h未死亡的雞胚經(jīng)4℃過夜，雞胚多呈現(xiàn)周身發(fā)紅、出血。未死亡雞胚頭頸部出血明顯，并存在不同程度的水腫。通過血凝試驗(yàn)可知，尿囊液能夠凝集10 mL/L的雞紅細(xì)胞，凝集價(jià)在1~4 log2之間。

2.3 F基因擴(kuò)增結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，采集的4份病料均擴(kuò)增363 bp的條帶。

2.4 序列分析結(jié)果（見圖3、圖4）

由測序結(jié)果可知，4株NDV分離株的112~117位的氨基酸序列均為GRQGRL，與標(biāo)準(zhǔn)的弱毒株具有相同的序列，并非強(qiáng)毒株應(yīng)有的RRQKRF序列。第101位、121位氨基酸序列為R和I，也與弱毒株相同，這些位點(diǎn)均為區(qū)分強(qiáng)弱毒株的位點(diǎn)。結(jié)果表明，4株NDV山西分離株均為弱毒株。毒株F基因的親緣關(guān)系和同源性見圖3、圖4。

由圖3可知，4株NDV山西分離株均與Clone30、La Sota、VG/GA株等位置接近，處于同一個(gè)分支，即具有最近的親緣關(guān)系，與基因Ⅶd型毒株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

由圖4可知，本研究分離到的4株NDV山西分離株相互之間具有較高的同源性。與其他毒株的同源性中，以與Clone30、La Sota以及VG/GA株的同源性最高。

2.5 NDV分離株毒力測定結(jié)果（見表1）

由表1可知，MDT指數(shù)最高的是SX-1和SX-4，均為120.00；IVPI指數(shù)中SX-4最高，為0.6；ICPI指數(shù)均為0；由此判定分離到的4株NDV均為弱毒株。

表1 NDV分離株毒力測定結(jié)果Tab.1 Result of virulence of NDV isolates

2.6 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果

雛雞在攻毒后第4 d開始出現(xiàn)發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退，個(gè)別雛雞糞便呈黃綠色，但未出現(xiàn)病雞死亡。對發(fā)病雞進(jìn)行剖檢，腺胃乳頭上有散在的點(diǎn)狀出血；十二指腸黏膜上有出血點(diǎn)，雙側(cè)盲腸扁桃體均腫大出血。采集內(nèi)臟進(jìn)行PCR檢測，均可以檢測到NDV。

3 討論

通過PCR鑒定，確定所采集的病料中含有NDV。針對不同雞場采集的病料中分離的NDV分別接種雞胚尿囊液培養(yǎng)，分離出4株NDV病毒，對其F基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)均與Clone30、La Sota以及VG/GA株等弱毒株同源性最高，且具有較高的親緣關(guān)系，可知本次分離到的毒株為弱毒株，屬于基因Ⅱ型。生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果也表明，該NDV病毒毒株為弱毒株。對分離NDV進(jìn)行動物回歸試驗(yàn)，結(jié)果表明其具有明顯的致病性，雖然其與Clone30、La Sota等疫苗株具有較高的同源性，但并非疫苗株。

基因Ⅶ型已經(jīng)成為我國NDV流行的主要優(yōu)勢基因型[4]。全國各地紛紛報(bào)道了該地區(qū)分離到的NDV為基因Ⅶ型強(qiáng)毒株。張賀楠等[5]于2016年在山東分離到NDV強(qiáng)毒株，屬于基因Ⅶd型。朱小甫等[6]從陜西省渭南市分離到NDV強(qiáng)毒株，屬于基因Ⅶ型。胡北俠等[7]甚至從蛋雞輸卵管積液中分離到基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株。山西也有分離到基因Ⅶd型NDV的相關(guān)報(bào)道[8]。而本次從山西地區(qū)分離到的病毒均為基因Ⅱ型弱毒株。說明在山西地區(qū)同時(shí)存在NDV基因在Ⅱ型弱毒株的流行。

當(dāng)前的弱毒疫苗毒株均為基因Ⅱ型，本次分離株均與疫苗株同屬基因Ⅱ型，主要位點(diǎn)氨基酸序列一致，應(yīng)不存在保護(hù)力不足的問題。而本次采樣的養(yǎng)雞場均免疫過新城疫疫苗，說明這些雞場免疫失敗。常見免疫失敗的原因有疫苗質(zhì)量、運(yùn)輸和保存、種類的選擇不當(dāng)、劑量不足或過量和接種途徑不當(dāng)?shù)萚9]。經(jīng)過與這些養(yǎng)殖場主進(jìn)行溝通和交流，發(fā)現(xiàn)在這些養(yǎng)雞場中均存在一些免疫失敗的因素。

本次分離病毒的發(fā)病雞均為混合感染，未表現(xiàn)出新城疫的臨床癥狀，最初懷疑其他疾病，但剖檢可見疑似新城疫的病變，并從中分離到新城疫病毒。由此推斷，非典型新城疫的感染可能普遍存在，在臨床診斷中不可忽視，一旦確診要及時(shí)進(jìn)行大劑量疫苗緊急接種[10]。

4 結(jié)論

從山西地區(qū)分離到4株NDV，通過基因序列分析鑒定NDV均為基因Ⅱ型弱毒株，生物學(xué)毒力試驗(yàn)證實(shí)分離毒株均為弱毒株。經(jīng)動物回歸試驗(yàn)確定本次分離的NDV均有致病性，表明在山西地區(qū)存在NDV弱毒株的流行，應(yīng)在養(yǎng)殖中加以預(yù)防。