藏豬仔豬黃痢病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

王 旭，張宏莉，高語馨，付劍波，王 權(quán)，周貴鳳

（四川民族學(xué)院農(nóng)學(xué)院，四川康定626001）

藏豬是我國寶貴的地方品種資源，具有繁殖力低、成活率低的特點(diǎn)，因此提高仔豬的存活率是藏豬養(yǎng)殖的重要任務(wù)。藏豬仔豬黃痢病是藏豬養(yǎng)殖過程中常發(fā)疾病，其發(fā)病時(shí)間早、發(fā)病急、流行性廣、病死率較高、易產(chǎn)生耐藥性[1]，導(dǎo)致該病臨床治療極其困難。試驗(yàn)通過對藏豬仔豬黃痢病原菌分離、純化、鑒定，對分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感藥物，為藏豬養(yǎng)殖戶合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

抗菌藥物藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）、營養(yǎng)瓊脂（NA）（上海博微生物科技有限公司BW006）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）（上海博微生物科技有限公司20200715）、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）（杭州微生物試劑有限公司M0001）、LB瓊脂（上海博微生物科技有限公司）、伊紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（上海博微生物科技有限公司）、腸桿菌科生化鑒定試劑盒（廣州環(huán)凱微生物有限公司HKI006）等。

1.2 儀器

超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、病料袋、手套、無菌牙簽、棉簽、無菌培養(yǎng)皿、試管、離心管、記號筆、標(biāo)簽紙、裝有冰袋的泡沫箱等。

1.3 病料來源

四川省甘孜州康定市姑咱鎮(zhèn)附近藏豬2020~2021年仔豬黃痢病例。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 糞便采集

選取臨診時(shí)發(fā)現(xiàn)的疑似病例，從每窩中選擇典型的發(fā)病仔豬的新鮮糞便，使用干凈的竹簽深入糞便內(nèi)部多角度取材，取材范圍要求大小不低于3 cm直徑。

1.4.2 病原菌分離

將采集病料使用生理鹽水按照1∶9比例稀釋，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況；挑選普通培養(yǎng)基分離的菌落分別接種于麥康凱瓊脂、伊紅亞甲藍(lán)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.4.3 生化試驗(yàn)

將初次分離的菌株使用腸桿菌科生化鑒定試劑盒進(jìn)行常規(guī)生化試驗(yàn)及三糖鐵斜面試驗(yàn)。

1.4.4 藥敏試驗(yàn)

使用抗菌藥物藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司），并采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[2]，測其抑菌圈大小，根據(jù)說明書判定病原菌對藥物的敏感性。將分離出的菌株進(jìn)行10-1稀釋，使用1~100μL的移液槍移取20μL菌液涂布于準(zhǔn)備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，選取藥敏片進(jìn)行均勻的貼區(qū)（5區(qū)，見圖1），每種藥物3組平行試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h，觀察其生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離、純化培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，平板上形成多數(shù)單個圓形菌落以及少許成片的菌苔，顏色為乳白色，形態(tài)為半透明，表面濕潤、凸起，表面及邊緣較光滑。

2.1.2 麥康凱瓊脂培養(yǎng)結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，平板上形成紅色單個菌落或紅色菌苔，表面光滑濕潤微凸，邊緣整齊。

2.1.3 伊紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)結(jié)果（見圖4）

由圖4可知，平板上形成黑色具有金屬光澤、邊緣整齊、圓形、表面微隆起的單個菌落或少許菌苔。

2.1.4 染色鏡檢（見圖5）選取麥康凱平板上的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。由圖5可知，視野中出現(xiàn)粉紅色、兩端鈍圓、短桿及少許長桿、散在或是成對出現(xiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌。

2.2 分離菌株生化鑒定結(jié)果（見表1、表2）

表1 分離菌株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical test and identification results of isolated strains

表2 三糖鐵斜面試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental results of trisugar iron inclined plane

由表1、表2可知，并對照配套說明書，綜合判定該菌株屬于ATCC類中的大腸埃希菌屬。

2.3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

由表3可知，分離的10株菌株對頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢拉啶、頭孢曲松、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、卡那霉素、慶大霉素、哌拉西林、羧芐西林、丁胺卡那、氯霉素、米諾環(huán)素等19種藥物敏感；對多西環(huán)素、克林霉素、多黏菌素、新霉素4種藥物中度敏感；對青霉素、氨芐西林、苯唑西林、紅霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、萬古霉素7種藥物則呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。

表3 病原菌對30種抗菌藥物的敏感性Tab.3 Susceptibility of pathogenic bacteria to 30 kinds of antibiotics

3 討論

通過對細(xì)菌分離純化鑒定表明，分離的10株藏豬仔豬黃痢病原菌均為大腸埃希菌，屬革蘭氏陰性菌。分離菌株主要對頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類等藥物敏感，主要原因是氨基糖苷類藥物主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)利用細(xì)胞膜將細(xì)胞外孔蛋白的藥物攝入細(xì)胞內(nèi)，使胞內(nèi)藥物大量蓄積，影響肽鏈的延長和蛋白質(zhì)合成，造成蛋白質(zhì)翻譯錯誤，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)裂痕、胞內(nèi)的AMP、K+等重要物質(zhì)外泄，使細(xì)菌死亡[3]。頭孢菌素類對革蘭陰性菌的外膜透過性較好，屬廣譜抗菌類藥物[4]。磺胺類藥物通過抑制菌體在葉酸代謝循環(huán)過程中合成二氫葉酸，進(jìn)而抑制細(xì)菌DNA及蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)菌生長繁殖遲緩[5]。喹諾酮類藥物主要通過抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，干擾DNA正常的復(fù)制轉(zhuǎn)錄等，使細(xì)菌死亡而發(fā)揮作用[6]。

試驗(yàn)中的菌株對青霉素類、部分大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、糖肽類等藥物呈現(xiàn)低敏或耐藥，一方面是由于藥物作用的機(jī)制不同，如，青霉素類藥物主要通過抑制胞壁粘肽合成酶（青霉素結(jié)合蛋白，PBPs）而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，引起細(xì)菌胞壁缺損，使菌體膨脹裂解而亡[7]；由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖含量少，且具有由脂多糖、脂質(zhì)雙層（磷脂）、脂蛋白組成的糖蛋白磷脂外膜[8]，阻礙藥物進(jìn)入到胞內(nèi)，故與革蘭氏陽性菌相比不容易受到青霉素類藥物的影響；同理，糖肽類藥物目前主要是治療革蘭氏陽性菌，而大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌，因此試驗(yàn)中分離菌株對萬古霉素不敏感[9]。另一方面則是由于不合理用藥導(dǎo)致病原菌對藥物產(chǎn)生了耐藥性。

該地區(qū)藏豬養(yǎng)殖場豬發(fā)病時(shí)，主要根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)用藥。同一類型藥物使用頻率過高，或療程不足時(shí)頻繁更換以及盲目聯(lián)合使用抗菌類藥物均促使耐藥菌株代替敏感菌株，產(chǎn)生耐藥性。但致病菌對不同藥物其產(chǎn)生耐藥的作用機(jī)制也有所差異，主要與結(jié)構(gòu)、功能等變化有關(guān)。如PBPs是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特異性靶蛋白，目前已證實(shí)PBPs的結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變是引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一[10]。細(xì)菌對四環(huán)素耐藥主要是由于其所帶的耐藥質(zhì)粒可誘導(dǎo)產(chǎn)生新蛋白，阻塞細(xì)胞壁水孔，細(xì)菌漿膜通透性發(fā)生改變，藥物無法進(jìn)入[11]。此外，細(xì)胞膜表面膜蛋白的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、形態(tài)等改變也會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌生物被膜（BF）是一種黏附定植式包膜，具有特定的基因表達(dá)模式，當(dāng)抗菌藥物作用于BF時(shí)觸發(fā)特定基因表達(dá)，使具有BF的細(xì)菌對該藥物產(chǎn)生耐藥性。有研究表示，目前已被證實(shí)具有生物被膜的動物源性細(xì)菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假結(jié)核棒狀桿菌等，由此本試驗(yàn)中分離的大腸埃希菌對部分藥物產(chǎn)生耐藥性也可能與BF有關(guān)[12]。

4 結(jié)論

試驗(yàn)從藏豬仔豬黃痢病例糞便中分離得到10株病原菌，經(jīng)分離鑒定其為大腸埃希菌。結(jié)果表明，該菌株對頭孢菌素類、喹諾酮類、磺胺類、硝基呋喃類、氨基糖苷類、酰胺醇類等藥物敏感，對青霉素類、部分大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、糖肽類等藥物低敏或產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。建議該地區(qū)后期治療該病時(shí)選擇國家批準(zhǔn)的敏感性藥物治療，規(guī)范使用抗生素或抗菌藥物，盡量避免致病菌產(chǎn)生耐藥性。