戊二醛癸甲溴銨對鏈球菌的消毒效果評價

王利平，譚東鶴，劉新月，趙會敏，李 鵬*

（1．新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2．浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州310018）

近年來大量動物疫病的暴發(fā)，養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖者對疫病預(yù)防愈發(fā)重視，而消毒工作是疾病預(yù)防過程中重要環(huán)節(jié)之一。畜禽經(jīng)常與人類生活環(huán)境親密接觸，為感染疾病創(chuàng)造了條件，養(yǎng)殖者開始采用一些物理、化學(xué)、生物類消毒方法進(jìn)行控制[1]。消毒是為了殺滅物體外表附著的細(xì)菌，防止感染畜禽，也可以更好地控制畜禽舍內(nèi)空氣污染情況[2]。目前市場上的消毒劑大多均是通過將病原媒介上的微生物徹底殺滅，以達(dá)到對各種病菌病毒的有效控制，從而實現(xiàn)無害化要求[3]。

我國最早使用戊二醛癸甲溴銨溶液作為新一類消毒劑，是因為其繼承了醛類消毒劑和季銨鹽類消毒劑的優(yōu)點，能夠達(dá)到雙重殺菌消毒效果[4]。戊二醛癸甲溴銨復(fù)合消毒劑是市場上比較常用的消毒劑，主要應(yīng)用于豬舍環(huán)境殺菌、消毒池消毒。焦西斌等[5]針對戊二醛季銨鹽復(fù)合制劑應(yīng)用于臨床消毒進(jìn)行了研究，但是少有關(guān)于戊二醛癸甲溴銨溶液消毒劑用在實驗室內(nèi)的消毒報道。戊二醛癸甲溴銨溶液低毒性，受有機(jī)物、溫度以及金屬腐蝕性的影響較小，在醫(yī)療應(yīng)用中能延長醫(yī)療器械的使用時間，從而維持設(shè)備使用安全[6]。我國出現(xiàn)人被傳染禽流感、豬鏈球菌病等疫病，不僅影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)，也威脅到人類的健康。隨著我國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖場周圍的生活環(huán)境污染越來越多地受到重視[7]。為研究配比不同濃度條件下的戊二醛癸甲溴銨溶液對鏈球菌的消毒效果，試驗采用豬鏈球菌為試驗指示菌，以抑菌圈試驗和懸液定量殺菌試驗為判斷標(biāo)準(zhǔn)，以期為畜牧業(yè)中開展消毒防疫工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗指示菌

鏈球菌由新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

戊二醛癸甲溴銨溶液，由新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)實驗室保存；吐溫80、甘氨酸、硫代硫酸鈉、卵磷脂，均購自北京索萊寶科技有限公司；BHI液體培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 儀器

DGX-9143B-1干烤箱、DPX-9082B-1恒溫培養(yǎng)箱、DL-CJ-1N超凈工作臺、BXM-30R立式壓力、蒸汽滅菌器、37℃恒溫?fù)u床、ESJ200-4電子天平、BCD-172JA冰箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 消毒劑的制備

在無菌、常溫條件下，取成品戊二醛癸甲溴銨溶液與無菌硬水比例為1∶10活化30 min，作為稀釋后待測液備用。根據(jù)產(chǎn)品含量說明，將消毒劑戊二醛癸甲溴銨分別稀釋至9.00、6.00、4.50、3.00、2.75和2.25 mg/L。

1.3.2 菌懸液的制備

取豬鏈球菌保存菌液按照1∶100的比例與BHI液體培養(yǎng)基混合，37℃、160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12~14 h制成菌懸液備用。培養(yǎng)后的菌液按照1∶10的比例，37℃、160 r/min、3 h條件下進(jìn)行第2次搖菌，即對數(shù)期菌液的制備[8]。根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》PBS滅菌處理后的菌液，無菌環(huán)境下，制備濃度為5×106~5×107CFU/mL的菌懸液。

1.3.3 抑菌圈試驗

準(zhǔn)備LB固體平板，取100μL菌懸液涂布均勻后，使用200 μL移液槍槍頭進(jìn)行打孔，孔徑約為6 mm；每孔加入50μL不同濃度無菌硬水稀釋的消毒劑[9]，并以無菌硬水作為陰性對照；置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)14~16 h，對出現(xiàn)抑菌圈的平板進(jìn)行測量。

1.3.4 中和劑篩選試驗

根據(jù)消毒劑技術(shù)規(guī)范，篩選的中和劑為3%吐溫80+1%甘氨酸，根據(jù)上述抑菌試驗結(jié)果選擇消毒劑濃度為3 mg/L。

第1組：吸取消毒劑4.5 mL于試管內(nèi)，置（20±1）℃水浴中5 min，吸加0.5 mL菌懸液，混勻，作用至預(yù)定時間，吸取樣液0.5 mL于含有4.5 mL稀釋液試管中混勻。吸取最終樣液1.0 mL，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。

第2組：吸取消毒劑4.5 mL于試管內(nèi)，置（20±1）℃水浴中5 min，加0.5 mL菌懸液混勻，作用10 min，吸樣液0.5 mL加含4.5 mL中和劑溶液管中混勻，作用10 min。吸取最終樣液1.0 mL，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。若平板生長菌落數(shù)均超過300個，應(yīng)以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計數(shù)。

第3組：吸取中和劑4.5 mL于試管內(nèi)，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌懸液混勻，作用10 min。吸取最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0 mL，分別接種于平皿中，37℃恒溫培養(yǎng)14~16 h后，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。

第4組：吸取中和產(chǎn)物溶液（以1份消毒劑加9份中和劑，作用10 min配制而成）4.5 mL于試管內(nèi)，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌懸液混勻。作用10 min，吸取最終樣液0.5 mL，使用中和產(chǎn)物溶液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0 mL，分別接種于平皿中，37℃恒溫培養(yǎng)14~16 h后，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。

第5組：吸取PBS 4.5 mL于試管內(nèi)，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌懸液混勻。作用10 min，吸取最終樣液0.5 mL用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取1.0 mL，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。

第6組：分別吸取PBS與中和劑各1.0 mL于同一無菌小平皿內(nèi)，倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基15～20 mL培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細(xì)菌生長，可能提示試驗材料或操作過程中有污染，應(yīng)重新進(jìn)行試驗[12]。

1.3.5 懸液定量殺菌試驗

取100μL菌懸液，注入900μL BHI培養(yǎng)液中，室溫下160 r/min搖床進(jìn)行培養(yǎng)3 h。把搖床后溶液用滅菌PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋。使用無菌硬水將消毒劑配制至所需待測濃度，分別取100 μL菌懸液，加入900 μL濃度分別為2.25、2.57、3.00、3.60、4.50 mg/L的消毒劑中，振蕩混合均勻，在常溫條件下作用10 min，再取100 μL反應(yīng)液與900μL中和劑混勻，再次振蕩，最后取10μL點涂于相應(yīng)營養(yǎng)平板上[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈試驗結(jié)果（見表1、圖1）

由表1和圖1可知，在抑菌驗條件下，戊二醛癸甲溴銨對豬鏈球菌無明顯抑菌效果。

表1 抑菌圈試驗Tab.1 Bacteriostatic circle experiment

2.2 中和劑鑒定試驗結(jié)果（見表2、圖2）

表2 中和劑鑒定試驗Tab.2 Neutralizer Iidentification experiment

由表2可知，第1組和第2組無菌落生長；第3組、第4組和第5組有菌落生長，且數(shù)量均大于300；第6組無菌落生長，符合中和劑試驗判定標(biāo)準(zhǔn)。可判定PBS稀釋的1.5%吐溫80+0.5%甘氨酸可以有效終止戊二醛癸甲溴銨對菌體的作用。

由圖2可知，在戊二醛癸甲溴銨溶液消毒劑有效濃度為3.00、3.60、4.50μg/L的時候，常溫下作用10 min后可完全對試驗菌進(jìn)行殺滅。戊二醛癸甲溴銨溶液消毒劑在一定濃度下可以有效殺滅豬鏈球菌。

3 討論

畜禽業(yè)集約化養(yǎng)殖已成為當(dāng)前養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)采用較多的一種養(yǎng)殖方式，但是這種養(yǎng)殖方式由于環(huán)境不衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理以及免疫程序不科學(xué)等情況的影響，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病暴發(fā)。對細(xì)菌病毒傳播抑制不當(dāng)，會造成混合性感染和繼發(fā)性感染。試驗針對戊二醛癸甲溴銨溶液對病原微生物的消毒效果的分析，在制備試劑時，選擇適當(dāng)?shù)谋壤ＷC了接下來的操作步驟的精確性[14]。從抑菌圈試驗結(jié)果可知，戊二醛癸甲消毒劑在不同濃度時抑菌效果相同，均對豬鏈球菌無效；中和劑篩選試驗中的第3組可判斷中和劑是否對消毒劑的殺菌效果產(chǎn)生影響[15]。在試驗過程中，節(jié)省人力、物力等成本，使結(jié)果有更明顯的對比，并排除了平板間差異帶來的影響。但試驗的靈敏性相對較小，不利于對試驗進(jìn)行精確的分析[16]，試驗結(jié)果有細(xì)小的偏差。

4 結(jié)論

研究可知，戊二醛癸甲溴銨溶液消毒劑在有效濃度為3.00、3.60、4.50μg/L，常溫條件下作用10 min后完全殺滅試驗指示菌。要準(zhǔn)確分析、評價消毒劑的消毒效果，應(yīng)了解每類消毒劑最適消毒濃度。本試驗結(jié)果為更高效使用消毒劑，做好疾病防護(hù)提供了一定參考。