Vero細胞懸浮馴化及增殖雞傳染性支氣管炎病毒工藝研究

程 旭，姜 逸，高明燕，周 生，俞 燕，李建梅，沈欣悅，范建華

（中國農業科學院家禽研究所，江蘇揚州225125）

雞傳染性支氣管炎是嚴重威脅養殖業的疫病之一，接種疫苗是目前最有效的預防措施。傳統胚苗存在潛在外源病毒污染、病毒傳代變異、后期雞胚污染等問題，因此細胞苗是當前疫苗研發的主要方向。隨著細胞需求量及產業化需要，大方瓶或轉瓶已無法滿足生產企業的需求。懸浮培養能夠提高細胞培養的質量和病毒表達量[1]，克服了傳統貼壁培養細胞生產的單批產量不高、批間差異大、產品質量不穩定、生產成本高和污染概率高等缺陷，節省人力成本，提高病毒增殖效率[2]。Vero細胞是WHO推薦獸用疫苗生產的傳代細胞系，可通過生物反應器實現規模化培養。本研究采用QX型雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）毒株MJ株開展Vero細胞懸浮培養，取得最佳培養參數，為IBV細胞苗的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細胞及毒株

Vero細胞及IBV細胞適應株MJ株均為中國農科院家禽研究所保存。

1.1.2 試劑與設備

試劑：微載體Cytodex-1（美國GE Healthcare公司）、胎牛血清DMEM（浙江天杭生物科技股份有限公司）、MEM（美國Gibco公司），其他均為國產分析純試劑。

設備：Countess II全自動細胞計數儀（美國賽默飛公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物反應器及Cytodex-1的前處理

超純水沖刷清洗干凈的生物反應器2遍。烘干后在生物反應器內壁均勻涂抹甲基二氯硅烷，然后放入180℃烘干箱內2 h。室溫條件下將適量的微載體Cytodex-1倒入PBS中浸泡2 h，棄掉上清，PBS沖洗2遍。

1.2.2 最佳微載體濃度試驗

分別采用微載體濃度為5、10、15 g/L進行試驗，于不同時間取樣計數，進行5組平行試驗，并對接近平均值的數據分析繪制生長曲線。

1.2.3 最佳培養基試驗

生物反應器中分別以MEM、DMEM培養基培養Vero細胞，于不同時間取樣，繪制生長曲線，確定最佳培養基。

1.2.4 篩選最佳血清濃度試驗

確定最佳培養基的情況下，配制胎牛血清濃度分別為5%、10%、15%的培養基，生物反應器懸浮培養Vero細胞，分析并繪制生長曲線，確定血清濃度。

1.2.5 篩選最佳接種密度

將Vero細胞以30、50、80 cell/球的細胞密度接種到生物反應器中，觀察細胞生長狀態確定最佳細胞接種密度。

1.2.6 細胞計數

將細胞液滴入細胞計數玻片中，明場模式下使用Countess自動細胞計數儀計數。

1.2.7 IBV MJ株最佳感染復數（MOI）

以確定的最佳懸浮培養條件為基礎，將IBV MJ株按MOI 0.05、0.10、0.50、1.00接入細胞，72 h后每12 h取樣1次，檢測TCID50，比較不同MOI下的病毒增殖情況。

1.3 數據統計與分析

數據采用SPSS 21.0進行分析，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同微載體濃度對細胞增殖的影響（見圖1）

由圖1可知，微載體濃度為5 g/L時細胞生長良好；微載體濃度為10 g/L時較5 g/L細胞生長速度快，72 h時顯著高于5 g/L組（P＜0.05）；15 g/L組與10 g/L組差異不大。

2.2 不同培養基對細胞增殖的影響（見表1）

由表1可知，DMEM組在各時間段細胞數量顯著高于MEM組，且細胞形態良好（P＜0.05）；DMEM組在48 h到72 h細胞數量明顯增多。

表1 不同培養基對細胞增殖的影響Tab.1 Effect of different media on cell proliferation單位：×105/mL

2.3 不同血清濃度對細胞增殖的影響（見圖2）

由圖2可知，5%血清組培養至72 h有許多游離細胞，無法貼壁；10%血清組在24 h后全部吸附微載體，至72 h形成致密的細胞層；15%血清組與10%無差異。

2.4 不同接種密度對細胞增殖的影響

以篩選的微載體10 g/L、10%DMEM為基礎，密度分別定為30、50、80 cell/球懸浮培養細胞。結果表明，30 cell/球組至72 h細胞數量較少仍未長滿微載體，微載體利用率低；80 cell/球組由于細胞量過大，至72 h有許多游離細胞未能吸附載體，造成細胞浪費；50 cell/球組至72 h幾乎所有細胞均能吸附在微載體上，生長狀態良好。

2.5 不同MOI對病毒增殖的影響（見表2）

以篩選的微載體10 g/L、10%DMEM、50 cell/球為基礎，MJ株按0.05、0.10、0.50、1.00接種。由表2可知，所有組在72 h后病毒效價均緩慢上升，108 h時達到峰值后下降；MOI為0.50時 在108 h病 毒 效 價 達 到6.53，高 于MOI 0.05、0.10組；MOI為1.00時，由于病毒接種量過高，病毒并不能完全吸附細胞，病毒增殖效價并不高，故MJ株最佳感染復數為0.50。

表2 不同MOI對病毒增殖的影響Tab.2 Effect of different MOI on virus proliferation單位：lgTCID50/mL

3 討論

隨著獸用疫苗的發展，細胞培養技術開始應用于生產疫苗[3]。懸浮培養利用生物反應器大規模培養細胞，整個過程中可實時控制參數，以便控制細胞生長狀態[4]。懸浮培養在實現大規模培養的同時，能穩步提高產品的質量，獲得優質的生物制品[5]。美國Med Immune公司使用MDCK細胞生產流感疫苗，奧地利Baxter公司利用Vero細胞培養流感疫苗[6]。國內懸浮培養技術已應用于禽流感、口蹄疫、豬圓環病毒的抗原生產[7]。以生物反應器為基礎的微載體懸浮培養技術是動物疫苗生產的主流趨勢，應從工藝上對細胞進行馴化，還應注意培養基優化、培養濃度及工藝等諸多因素[8]。

目前IBV弱毒活苗主要通過雞胚連續傳代致弱，但無法掌握毒株致弱程度，有毒力返強風險[9]。通過細胞系傳代可有效避免風險，但IBV毒株因一直無適應的傳代細胞系，制約了IBV致病機制及疫苗的研究。病毒適應細胞的能力與病毒的自然宿主、病毒原發器官和細胞類型有關。細胞在攪拌的情況下實現懸浮狀態，細胞馴化難度較大，需要多代次的選擇和馴化才能成功[10]。Coria等[11]報道IBV適應雞胚后很難適應Vero細胞，若先適應雞腎細胞后在Vero細胞上生長可能性將提高。Cunningham等[12]將IBV適應鼠腦傳代后接種Vero細胞傳代，病毒獲得適應。本研究所獲得的IBV細胞適應株MJ株是在Vero細胞上多次傳代獲得的。

前期研究表明，MJ株接種雛雞后能夠有效抵抗IBV強毒侵襲，具有良好的免疫原性，可作為IBV后備細胞苗的開發[13]。采用微載體懸浮培養Vero細胞進行MJ株的增殖，可為以后疫苗的產業化提供研究基礎。本研究結果表明，10 g/L微載體濃度、10%DMEM培養條件下，細胞與微載體接種比例為50 cell/球時，細胞生長狀態良好，微載體空球率較低。在Vero細胞懸浮培養基礎上，篩選出MJ株按照MOI為0.5的感染劑量病毒擴增效率最高，108 h時病毒含量能夠達到106.53TCID50/mL。

4 結論

將IBV接種Vero懸浮細胞，病毒效價較雞胚增殖提高并不顯著，可能與IBV吸附感染懸浮狀態下細胞的互作機制有關，如何有效提高病毒增殖效率有待進一步研究。