多重PCR靶向富集結合高通量測序在子宮內膜癌MMR基因突變篩查中的應用

侯青霞 黃好亮 張 沛 周玉飛

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在我國女性生殖道惡性腫瘤中位于第二位，僅次于宮頸癌，但在北京、上海、廣州等部分地區，EC已成為女性生殖道惡性腫瘤的首位[1]。近來研究表明，EC發病率及死亡率將呈現上升趨勢[2]。EC患者約有5%具有遺傳易感性，在以EC為表現形式的遺傳綜合征中最為常見的是林奇綜合征(Lynch syndrome，LS)，故稱之為LS相關EC[3]。LS又稱為遺傳性非息肉性結直腸癌綜合征(HNPCC)，是一種由MMR基因種系突變引起的常染色體顯性遺傳病。LS家族攜帶MMR種系突變基因的女性終生患EC的風險為60%，而非LS家族的普通人群僅為2.3%[4]。目前，EC真正的發病原因目前尚不十分清楚，研究顯示約20%EC患者有家族史，表現出微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)，說明與MMR基因的突變有關[5]。LS患者常常會同時性或異時性地患有多種腫瘤，患結直腸癌的概率約80%，患EC的終生風險為40%～60%。但是在女性LS患者中，EC的幾率大于或等于其發生結直腸癌的幾率，并且約50%患者是以EC為首發，因此EC可以視為LS的“前哨”腫瘤[6]。目前LS的研究集中在腸癌，對腸外腫瘤尤其是女性LS高發的EC的研究非常少，臨床缺乏對于EC高危人群的篩查指標，本研究采用多重PCR靶向富集結合新一代高通量測序技術對MMR基因進行檢測，旨在分析MMR基因在豫西地區女性中的分布頻率，評價MMR基因作為EC篩查指標的價值，深入研究MMR基因調控機制，從而為EC臨床規范化治療提供更多資料。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選擇2014年2月至2018年6月經病理學確診為EC的86例豫西地區女性患者為研究對象。入組患者均為新發EC，年齡45～75歲。對患者的病史、家族史及臨床病理特點進行詳細采集，包括：EC發病時間、腫瘤分級和分期、發病部位、有無脈管瘤栓、發病時間間隔、有無糖尿病、高血壓及肥胖(BMI≥28)等危險因素、癌抗原CA125、一級或二級親屬中有無惡性腫瘤病史(尤其是乳腺癌、結直腸癌、女性生殖腫瘤)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者及志愿者均簽署知情同意書。

1.2 高通量測序技術檢測MMR基因

采集所有患者和健康人外周靜脈血8 ml，用DNA提取試劑盒(血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。采用電泳檢測DNA的質量，用Qubit3.0熒光定量儀及配套的核酸定量試劑盒(Qubit dsDNA HS Assay Kits，購自Thermo Fisher Scientific)對DNA進行濃度檢測。通過多重PCR的方法，特異性的捕獲MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的突變區域，PCR體系中每個樣本均有各自對應的標簽，PCR結束即完成文庫構建。對構建的文庫采用磁珠法進行純化，然后用Qubit3.0熒光定量儀和配套的核酸定量試劑盒對每個文庫DNA進行濃度檢測。將多個文庫DNA按照等質量混合制備成上機文庫原液，濃度稀釋后采用Illumina Miseq測序儀上機測序。然后通過生物信息分析判斷靶序列是否發生突變。檢測流程如圖1所示，實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

圖1 高通量測序技術檢測MMR基因流程

1.3 Sanger測序法驗證

采用Sanger測序法驗證新一代高通量測序的結果。選取一些在高通量測序結果中有MMR基因位點變異的代表樣本DNA，進行PCR擴增，產物純化后采用Sanger測序檢測。Sanger測序法采用的PCR擴增引物和測序產物與新一代高通量測序法所用的一致。

1.4 隨訪調查

采用門診、住院復查或電話等方式對入組患者進行隨訪。隨訪時間的間隔參考了國內其他研究[7]。隨訪時間截止2020年12月。復發情況統計具體如下：對有無家族史患者的復發例數、不同病理分期患者的復發例數及復發時間進行分析統計，對復發患者的中位無瘤生存時間進行統計。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0進行統計學分析，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特點

入組患者年齡45～75歲，平均(58.0±6.2)歲；體重指數(BMI)16.4～27.1 kg/m2，平均(24.7±2.1)kg/m2；病理學類型子宮內膜樣腺癌74例(高分化26例，中分化33例，低分化15例)、子宮內膜透明細胞癌5例、癌肉瘤4例、腺鱗癌3例；手術病理分期ⅠA期36例，ⅠB期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；發病部位子宮下段38例，非子宮下段48例；有脈管瘤栓17例，無脈管瘤栓69例；首發腫瘤出現后，平均第二種腫瘤發病間隔5.8年，中位發病間隔為4.9年；CA125指標水平4.20～677.3 U/ml，平均(58.6±3.8)U/ml，其中34例患者超過正常水平；11例患者有糖尿病或高血脂病史。

2.2 MMR基因突變情況

高通量測序檢測結果顯示，86例樣本中發生MMR基因突變的共有66例，總突變率為76.8%。共發現12種非同義單核苷酸變異(SNV)、2種同義SNV。在非同義SNV中，位于MLH1基因上的突變類型有3個：p.I219V：c.A655G、p.V384D：c.T1151A、p.Q701K：c.C2101A；位于MSH2基因上的突變類型有3個：p.L390F：c.C1168T、p.T564A：c.A1690G、p.E809K：c.G2425A；位于MSH6基因上的突變類型有2個：p.G39E：c.G116A、p.E1163V：c.A3488T；位于PMS2基因上的突變類型有4個：p.R20Q：c.G59A、p.K541E：c.A1621G、p.P470S：c.C1408T、p.T485K：c.C1454A。在同義SNV中，位于MSH6基因上的突變類型有1個：p.T1102T：c.T3306A；位于PMS2基因上的突變類型有1個：p.S260S：c.C780G。每種突變類型對應的患者例數如表1所示。

表1 MMR基因突變情況

2.3 Sanger測序驗證結果

對MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因上不同突變位點的Sanger測序結果如圖2所示。將Sanger測序與新一代高通量測序的突變位點及堿基突變形式進行比對，結果均顯示一致。

圖2 部分樣本Sanger測序結果

2.4 復發情況

中位隨訪時間為54.0個月，隨訪期間，11例患者失訪，9(10.5%)例患者復發，其中5例在5年內復發，中位復發時間為48.2個月，4例在5年后復發，中位復發時間為56.6個月。不同年齡段復發例數差異無統計學意義(P=0.739)；有家族史組復發6例，無家族史組3例，有家族史組復發率明顯高于無家族史組(P=0.003)；ⅠA復發3例，ⅠB 2例，Ⅱ2例，Ⅲ1例，Ⅳ1例，差異無統計學意義(P=0.817)。中位無瘤生存時間為42.0個月，其中無家族史組、有家族史組中位無瘤生存時間分別為：(52.33±0.58)月、(36.33±1.21)月，差異具有統計學意義(P<0.001)。

3 討論

近年來，隨著人們壽命的延長、長期食用激素類藥物以及肥胖等高風險因素的增加，EC發病率趨勢逐漸上升。對于EC高危人群，除了關注患病的高危因素并改變不良生活習慣外，更重要的是要進行EC早期篩查，盡可能早期發現早期治療。普通女性人群患EC的概率為2.3%，而攜帶MMR突變基因的LS家族女性患EC概率高達60%，因此通過早期檢測MMR基因來篩查EC十分有意義。人類MMR基因能夠檢驗和校正復制期間發生在微衛星樣重復DNA序列上小的插入和丟失、防止解旋的DNA序列重新結合。而MMR基因一旦發生突變，MMR蛋白的功能將受到破壞，從而引起重復DNA序列的產生并且DNA修復出現錯誤，導致DNA表現為MSI。MSI會促使癌基因激活或抑癌基因失活，最終誘發癌變[8-10]。目前MMR基因突變檢測方法主要是一代測序，對單個樣本的多個基因檢測時，需要逐一進行，這種檢測方法成本高、速度慢、通量低，不適合臨床上做大樣本篩查工作。而多重PCR靶向富集結合新一代高通量測序可以對目標基因進行深度測序，從而可以高效準確的研究與疾病最相關的基因，并且高通量測序方法成本低、速度快、通量高，目前已經成為臨床上多種疾病進行相關基因檢測和生命科學研究的重要工具[11-12]。本研究采用多重PCR靶向富集結合高通量測序方法對EC患者樣本進行檢測，MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2突變類型的測序結果與Sanger測序結果一致，表明采用新一代高通量測序方法來檢測MMR基因的胚系突變的準確度可靠。86例豫西地區EC患者測序結果表明發生MMR基因突變的共有66例，總突變率為76.8%，說明豫西地區EC患者同時有MMR基因突變的概率高達76.8%。86例測序結果共發現12種非同義SNV、2種同義SNV。將本研究檢測出的突變位點在NCBI基因數據庫中檢索分析，發現導致EC致病或可能致病的突變類型是位于MLH1基因上的18號外顯子p.Q701K：c.C2101A；而MSH2基因上的14號外顯子p.E809K：c.G2425A的突變是致病性不確定的類型；剩下的8種非同義SNV和2種同義SNV均為可容忍的變異可能與EC的發生沒有關聯。范怡梅等首次發現p.Q701K：c.C2101A突變，提高了患者患胃腸腫瘤的風險[13]。YAP HL等在2例腫瘤樣本中檢測出p.Q701K：c.C2101A突變，但是在對照組非腫瘤樣本中未檢測出該突變，對2例突變樣本進行MSI檢測，共檢測出4個位點陽性[14]。本研究中致病或可能致病的類型p.Q701K：c.C2101A和p.E809K：c.G2425A的突變率高達11.6%，表明通過檢測MMR基因突變情況可以大概率的篩查出EC，因此針對EC高危人群，早期通過MMR基因檢測進行EC篩查顯得尤為重要，可以盡早進行治療干預。對EC患者復發情況隨訪，9例患者復發，復發率高達10.5%。其中5例在5年內復發，4例在5年后復發，不同年齡段復發例數差異無統計學意義(P>0.5)；有家族史組復發6例，無家族史組3例，有家族史組明顯高于無家族史組(P<0.5)；無家族史組、有家族史組中位無瘤生存時間分別為：52.0個月、36.0個月，差異具有統計學意義(P<0.5)，隨訪調查表明EC術后易復發，無瘤生存時間短。文獻研究表明在EC患者中，有5%的子宮內膜癌是和遺傳易感性有關的[3]。因此對于EC高危人群盡早進行MMR基因測序檢測，對患者早期治療及對臨床管理及指導用藥均具有重要意義。

國外對LS的研究已進行了多年，但在我國仍處于起步階段。對腸外腫瘤尤其是女性LS高發的EC的研究非常少，中國人群的EC的MMR基因大樣本研究還沒有開展。多重PCR靶向富集結合新一代高通量測序技術用于MMR基因的突變檢測成本低、速度快、通量高，可用于對EC高風險女性的篩查，從而為EC臨床規范化治療提供更多資料。