YAP、TAZ在人喉癌組織中的表達及其臨床意義

朱麗明 那學武 李海洲

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，好發于40歲以上男性，以聲門上型和聲門型多見，又以鱗癌為常見組織學類型[1]。目前喉癌的主要治療手段仍為手術切除，早期喉癌術后患者預后通常較好，5年生存率遠高于晚期患者[2]，且早期喉癌可行喉顯微激光手術切除，與傳統開放手術相比具有創傷小、恢復快、并發癥少等優點，患者無病生存率顯著上升[3]。而晚期患者通常只能行開放手術或無法手術，患者生存質量明顯下降。若能在喉癌早期對其進行診斷和治療，可以大大提升患者生存質量。近年來研究發現Hippo通路在腫瘤疾病的發生發展中扮演重要角色。Hippo通路最早發現于果蠅體內，具有高度保守的特點，在調控細胞增殖、促進組織再生等生命活動中發揮作用[4]。YAP蛋白是Hippo通路的重要效應器，和其旁系同源TAZ蛋白共同構成Hippo通路的關鍵轉錄共刺激分子[5]。YAP、TAZ在腫瘤中過表達促進腫瘤生長、浸潤，被認為是多種腫瘤的促癌基因[6]。研究表明多種腫瘤疾病中存在Hippo通路失活及YAP、TAZ高表達[7]，但其在喉癌中作用尚不明確。本研究旨在探討喉癌中YAP、TAZ的表達水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2012年3月至2015年3月于我院耳鼻咽喉頭頸外科就診的77例喉癌患者手術切除的腫瘤組織和正常癌旁組織。患者中男性66例、女性11例；年齡33歲～76歲，其中≥60歲43例，<60歲34例；聲門型57例，聲門上型20例；高分化13例，中分化38例，低分化26例；腫瘤直徑<2 cm者21例，≥2 cm者56例；有淋巴結轉移者24例，無淋巴結轉移者53例；根據國際抗癌聯合會UICCTNM分期標準(2002)進行分期，Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期36例。所有腫瘤組織經病理科驗證均為鱗癌，患者均為首次發病，未接受化療、放療、靶向治療和生物免疫治療。本研究所有研究對象均簽署對研究的知情同意書并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化法檢測組織中蛋白表達

組織蠟塊脫蠟水化，修復抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后滴加H2O2浸泡15 min，PBS沖洗后滴加山羊血清封閉，滴加一抗(YAP、TAZ一抗均購自美國BD生物公司，1∶200稀釋)，置于濕盒內4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗3次，室溫下滴加二抗孵育1 h，PBS沖洗后DAB顯色后蘇木精復染，梯度酒精脫水中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.3 結果判定

采用雙盲法評估結果，細胞質和(或)細胞核染為黃色、棕色或褐色記為陽性，每張切片選擇5個高倍鏡下視野(×200)，實用半量免疫評分法評價結果。陽性細胞占比：≤10%，記0分；>10%～25%，記1分；>25%～50%，記2分；>50%～75%，記3分；>75%，記4分。染色強度：黃色記1分、棕色記2分、褐色記3分。陽性細胞占比和染色強度相加，0～3分記為低表達，>3分記為高表達。

1.4 統計分析

實驗數據使用SPSS21.0軟件進行分析，比較蛋白表達差異采用χ2檢驗，蛋白表達與喉癌臨床病理因素的關系采用Fisher’s檢驗，相關性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier生存曲線對患者生存情況進行比較，統計結果以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 YAP、TAZ蛋白在喉組織中的表達情況

免疫組化結果顯示喉癌組織中YAP蛋白高表達率為85.7%，高于正常癌旁組織的23.4%，差異具有統計學意義(P<0.001)；TAZ蛋白高表達率為81.8%，高于正常癌旁組織的27.3%，差異具有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 YAP、TAZ蛋白在不同組織的表達情況(例，%)

2.2 YAP、TAZ蛋白表達與喉癌臨床因素的關系

患者組織中YAP、TAZ蛋白表達水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無關(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度相關(P<0.05)，見表2。

表2 YAP、TAZ蛋白表達與臨床因素的關系/例

2.3 喉癌組織中YAP、TAZ蛋白的相關性

YAP高表達的66例喉癌患者組織中，有41例同時存在TAZ高表達。Spearman相關分析顯示YAP表達與TAZ呈正相關(γ=0.244，P=0.025)。

2.4 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預后的關系

本研究中77例喉癌患者5年隨訪存活61例，死亡13例，失訪3例，5年存活率79.2%。本研究使用總生存時間作為患者的預后指標，所有死亡患者均死于喉癌及并發癥，無其他原因導致的患者死亡。66例YAP高表達喉癌患者中存活51例，死亡12例，失訪3例；11例YAP低表達喉癌患者中存活10例，死亡1例，無失訪。63例TAZ高表達喉癌患者中存活49例，死亡12例，失訪2例；14例TAZ低表達喉癌患者中存活12例，死亡1例，失訪1例。使用Kaplan-Meier法進行生存分析，結果顯示YAP、TAZ高表達患者5年生存率明顯低于低表達患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預后的關系

3 討論

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，以鱗癌多發，占所有患者的95%以上。喉癌的發生與多種因素相關，吸煙、飲酒、遺傳因素和HPV感染均能導致喉癌的發生[8]。隨著醫療技術的發展，腫瘤精準治療能夠大大提升早期喉癌患者的生存率[9]，但對晚期患者治療效果仍不明顯，且晚期喉癌易復發，常需要再行喉全切術，嚴重降低患者生活質量[10]，而目前還沒有監測晚期喉癌患者預后的特異性指標。近年來腫瘤分子標志物的研究受到廣泛關注，若發現與喉癌發病及預后相關的分子指標，就能夠對喉癌進行早期診斷或有效監測患者預后，有利于喉癌的診治。

Hippo通路自發現以來被證實存在于多種哺乳動物體內，有研究表明其在調節器官大小、免疫穩態和組織修復等多種生命活動中發揮作用[11]。在腫瘤中Hippo通路常作為抑癌基因調控細胞生長，通過磷酸化途徑抑制組織生長速度，調節細胞生長周期[12]。Hippo通路調控生命活動十分依賴其核心效應器YAP/TAZ的轉錄活性，通常情況下Hippo通路相關激酶抑制了YAP/TAZ的活性，但這種抑制關系在多種腫瘤中被解除[13]。研究表明許多腫瘤疾病中均存在Hippo通路相關基因缺失或表達異常，導致YAP、TAZ的高表達[14]，而YAP/TAZ具有促進細胞增殖、抑制凋亡作用，并在調節腫瘤干細胞發育的過程中扮演重要角色[15]。最近的研究發現，YAP/TAZ還通過調節腫瘤微環境促進腫瘤的生長，結腸癌中YAP能夠誘導巨噬細胞像M2表型極化，抑制機體抗腫瘤免疫[16]，而在前列腺癌中YAP/TAZ能夠耗竭體內樹突狀細胞完成免疫逃逸[17]。還有研究表明在乳腺癌中YAP/TAZ能夠促進上皮細胞間充質轉化，增強腫瘤細胞侵襲能力[18]，而在肝癌、肺癌、結腸癌等惡性腫瘤中YAP/TAZ的高表達常被視作疾病預后不良的指標[19]。本研究發現喉癌患者腫瘤組織中YAP/TAZ表達水平顯著高于正常癌旁組織(P<0.001)，可能與喉癌的發病相關，結果與文獻報道一致[20]。腫瘤組織中YAP/TAZ表達與患者疾病預后相關(P<0.05)，可能作為監測喉癌預后的相關指標發揮作用。

相關性研究發現喉癌組織中YAP表達與TAZ呈正相關(γ=0.244，P=0.025)，提示YAP/TAZ可能通過聯合途徑參與喉癌的發生發展。喉癌患者組織中YAP、TAZ蛋白表達水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無關(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度相關(P<0.05)，提示YAP、TAZ參與了喉癌的侵襲和轉移。

綜上所述，本研究通過檢測喉癌患者組織及癌旁正常組織中YAP、TAZ的表達情況，發現YAP、TAZ與喉癌的發生發展及預后相關，提示YAP、TAZ的表達能夠在監測患者預后中發揮作用。YAP和TAZ在喉癌組織中表達強度具有相關性，但二者在喉癌中的作用機制仍需進一步研究。