血清miR-92a、miR-196a表達與宮頸癌淋巴結轉移的相關性

孫 倩 王 宇 邱衛強

宮頸癌的治療主要為以手術及放化療為主的綜合治療，可有效延長患者的生存時間，但受多種因素影響，部分患者預后并不理想[1]。據報道，淋巴結轉移與宮頸癌患者預后密切相關，且合并淋巴結轉移的患者預后相對較差[2]。因此，明確宮頸癌患者淋巴結轉移情況尤為必要。目前已證實，微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)在細胞的多種生理過程中發揮作用，若miRNA異常表達可導致疾病發生，包括惡性腫瘤[3]。其中miR-196a被證實可促進胰腺癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤發生[4]。miR-92a也可通過多種信號在惡性腫瘤的發生發展、侵襲轉移中發揮作用[5]。結合上述機制，血清miR-92a、miR-196a的異常表達可能與宮頸癌淋巴結轉移也有一定關系，但目前相關報道較少。基于此，本研究將重點觀察血清miR-92a、miR-196a表達與宮頸癌淋巴結轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 納入對象

回顧性分析2018年6月至2019年12月醫院收治的44例伴淋巴結轉移的宮頸癌患者資料，納入淋巴結轉移組，另采集同期收治的44例無淋巴結轉移宮頸癌患者資料，納入無淋巴結轉移組。納入標準：①經病理檢查確診為宮頸癌；②首次就診；③均為原發腫瘤；④預計生存時間>3個月；⑤實驗室檢查資料、病例資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并其他婦科疾病；③術前接受放、化療等抗腫瘤治療；④術前伴有急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、血液系統疾病。

1.2 方法

1.2.1 淋巴結轉移評估方法 查閱所有患者入院時MRI、CT等影像學檢查資料，參照標準[6]，統計患者淋巴結轉移情況。

1.2.2 miRNA檢測方法 全部患者在入院時均接受血清相關指標的檢測，且檢測結果資料保存完整。入院時，采集患者清晨空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上層血清，加入1 ml提取劑Trizol，放置于-70 ℃冰箱中保存，按照總RNA快速提取試劑盒說明書，提取總RNA，采用美國ABI公司生產的7500型熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR反應，以U6為內參，miRNA逆轉錄反應體系15 μl∶5 μlRNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環引物，0.15 μl 100 mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，1μl 50U/μl逆轉錄酶，10×反轉錄緩沖液1.5 μl，0.19 μl 20 U/μl RNase抑制劑，4.16 μl雙蒸水。反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。擴增反應體系為20 μl∶1 μl引物及探針Mix(20×)，10μlTaqMam 通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反轉錄產物cDNA，7.67 μl雙蒸水。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復性60 s進行45個循環，每個反應體系熒光信號達到設定閾值所經歷循環數即為Ct值，采用2-△△Ct法計算miR-92a及miR-196a水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 基線資料統計 設計基線資料填寫表詳細記錄患者的一般資料，包括年齡、腫瘤直徑、病理類型[7][鱗癌、腺癌、其他(包括腺樣囊狀性癌、腺樣基底細胞癌、腺鱗癌、未分化癌等)]、分化程度(高分化、中分化、低分化)，血清腫瘤標志物[糖類抗原199(Carbohydrate antigen199，CA199)、糖類抗原125(Carbohydrate antigen125，CA125)，入院時取靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，采用放射免疫法測定]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 淋巴結轉移、無淋巴結轉移宮頸癌患者資料比較

淋巴結轉移宮頸癌患者的血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a均高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義(P<0.05)；組間其他基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 淋巴結轉移、無淋巴結轉移宮頸癌患者的基線資料比較

2.2 各主要指標與宮頸癌患者淋巴結轉移關系的回歸分析

將2.1中比較差異有統計學意義的變量納入作為自變量，將宮頸癌患者淋巴結轉移情況作為因變量(1=轉移，0=未轉移)，經Logistic回歸結果顯示，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a的異常表達可能與宮頸癌患者的淋巴結轉移有關，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a過表達可能是宮頸癌患者淋巴結轉移的風險因子(OR>1，P<0.05)，其中miR-92a、miR-196a的過表達檢驗所得的OR值較高，可作為獨立風險因子，見表2。

表2 各主要指標與宮頸癌患者淋巴結轉移關系的回歸分析結果

2.3 血清miR-92a、miR-196a預測宮頸癌患者淋巴結轉移風險的價值分析

將宮頸癌患者的血清miR-92a、miR-196a作為檢驗變量，淋巴結轉移情況作為狀態變量(1=轉移，0=未轉移)，繪制ROC曲線(圖1)結果顯示，血清miR-92a、miR-196a單一及聯合預測宮頸癌淋巴結轉移風險的AUC均>0.80，預測價值均較理想，且以聯合檢測價值最佳。各指標對應特異度、靈敏度、cut-off值及約登指數見表3。

圖1 血清miR-92a、miR-196a預測宮頸癌患者淋巴結轉移風險價值的ROC曲線圖

表3 血清miR-92a、miR-196a預測宮頸癌患者淋巴結轉移風險的價值分析結果

3 討論

據報道，部分宮頸癌患者在就診時便伴有淋巴結轉移，且隨著疾病的進展，淋巴結轉移發生率逐漸升高[8]。因淋巴結轉移與宮頸癌患者預后密切相關，若在早期明確淋巴結轉移發生情況，可能對疾病治療干預措施的制定有重要意義。

CA125、CA199是重要的血清腫瘤標志物，被證實與惡性腫瘤的發生發展密切相關，其中CA125為廣譜腫瘤標志物，是1種糖蛋白，主要從上皮性卵巢癌抗原中檢出，宮頸癌患者的血清CA125水平均有不同程度升高[9]。而CA199屬于黏液糖蛋白抗原，分布于胰腺、膽管上皮等，是存在血液循環的腫瘤相關抗原[10]。有相關研究采用CA125、CA199聯合診斷宮頸癌取得滿意效果[11]。由此猜測，血清CA125、CA199可能與宮頸癌患者淋巴結轉移有關。本研究在比較淋巴結轉移與無淋巴結轉移患者的血清CA125、CA199后，經Logistic回歸分析結果顯示，血清CA199、CA125異常表達與宮頸癌患者淋巴結轉移風險有一定關系，二者過表達可能是宮頸癌患者淋巴結轉移的風險因子。證實上述猜測，但因CA199、CA125不僅在諸多惡性腫瘤疾病患者血清中呈過表達，且在受炎癥、免疫等其他因素影響后，也有一定程度升高，特異性及穩定性不佳；且在本研究中二者經回歸分析所得的OR風險值也偏低，難以在評估宮頸癌患者淋巴結轉移中發揮重要作用，因此本研究未將其作為主要的指標觀察分析。

相關研究指出，miRNA具有腫瘤標靶的作用，可能同時兼具促癌基因和抑癌基因的作用[12]。而一個miRNA分子可靶向多個基因表達進而發揮生物學活性，miR-92a為生物體內重要的轉錄后調控因子，主要發揮癌基因作用，可促進癌細胞凋亡[13]。miR-196a作為miRNA家族中一員，已有不少研究證實，miR-196a在腫瘤組織中呈過表達，具有致瘤作用，可促進腫瘤生長，增強細胞對化療藥物敏感性，并與腫瘤患者預后密切相關[14]。由此，推測血清miR-92a、miR-196a也可能與宮頸癌患者淋巴細胞轉移有關。本研究結果顯示，淋巴結轉移宮頸癌患者的血清miR-92a、miR-196a均高于無淋巴結轉移患者，初步推測血清miR-92a、miR-196a可能與宮頸癌患者淋巴結轉移有關，且該推測在進一步的回歸分析檢驗中被證實，簡單分析原因：miR-92a過表達可導致某些靶向癌基因過度激活，通過抑制P21的表達和促進細胞周期進展來促進宮頸癌腫瘤細胞的增殖，繼而引起淋巴結轉移的發生[15]。而miR-196a可能通過參與并促進宮頸上皮癌變過程，具有促癌基因功能，同時通過調控多種基因促進宮頸癌細胞的增殖，如miR-196a過表達可下調Radixin基因表達，進而促進細胞侵襲，同時可通過調節PaP1A基因表達促進細胞的侵襲，進而誘發淋巴結轉移[16]。

在證實miR-196a、miR-92a與宮頸癌患者淋巴結轉移的關系后，進一步繪制ROC曲線發現，血清miR-92a、miR-196a單獨及聯合預測宮頸癌淋巴結轉移風險的AUC均>0.80，預測價值均較理想，且以聯合檢測價值最佳。上述結果不僅證實血清miR-92a、miR-196a與宮頸癌患者淋巴結轉移有關，且說明了血清miR-92a、miR-196a對未來宮頸癌淋巴結轉移風險的評估及預測有較高的應用價值，即宮頸癌患者若入院時血清miR-92a、miR-196a呈過表達，其可能有較高的淋巴結轉移風險，臨床應盡早行影像學或病理檢查，明確淋巴結轉移情況，可能對指導早期治療有積極意義；同時可在未來治療中將miR-92a、miR-196a作為靶基因，以為患者選擇合適的藥物治療，或可對延長患者的生存時間、改善生存質量有積極意義。

綜上所述，宮頸癌淋巴結轉移可能與血清miR-92a、miR-196a異常表達有關，若在入院時檢測患者血清miR-92a、miR-196a呈過表達，可能提示淋巴結轉移高風險。