欖香烯乳聯合化療對Lewis肺癌的影響及機制

范瑞娟 王 瑾 郭醒爽 楊 敏

近年來，肺癌的發病率和死亡率在全球范圍內呈現出加速增長的趨勢，臨床預后較差，5年總生存率低于15%[1]。肺癌的臨床治療仍以化療為基礎，但化療藥物的副作用限制了其臨床應用。中西醫結合可以達到降低毒性，提高效率的目的[2]。近年來，臨床腫瘤的治療越來越受到關注，特別是在改善癥狀，提高生活質量方面。欖香烯是從姜科溫莪術揮發油中提取的抗癌活性成分，主要活性成分是β-欖香烯，其在臨床使用中乳化以獲得欖香烯乳劑注射劑[3]。欖香烯的抗癌生物活性主要是抑制腫瘤細胞的有絲分裂過程，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長，并且具有較輕微的不良反應[4]。本次研究選取近交系C57BL/6小鼠40只，探討欖香烯乳聯合化療對Lewis肺癌的影響及機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取近交系C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。適應性喂養1周，人工光照明暗各12 h，溫度20 ℃～24 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和攝食。

1.2 實驗方法

1.2.1 Lewis肺癌小鼠模型建立 將Lewis肺癌細胞復蘇，并向RPMI-1640培養基中加入100 ml/L胎牛血清用于常規細胞培養傳代。在對數生長期，在無菌條件下將Lewis肺癌細胞懸浮液(2×106/ml)接種到2只C57BL小鼠的右腋皮下。接種14天后，通過脫臼處死2只C57BL荷瘤的小鼠，在無菌條件下取出腫瘤組織，根據腫瘤質量(g)與生理鹽水(ml)1∶3的比例制備腫瘤組織勻漿。將腫瘤組織勻漿(0.2 ml/只)接種另外38只C57BL小鼠，體重16～20 g，建立Lewis肺癌小鼠模型。

1.2.2 分組及給藥 隨機分為模型組、欖香烯乳組、化療組和聯合組，其中欖香烯乳組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳，化療組腹腔注射3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，聯合組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳、3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，連續7 d。

1.2.3 瘤體、脾臟及胸腺測量 取出小鼠脾臟和胸腺并稱重，并計算器官指數。用游標卡尺(精確到0.1 mm)每天在同一時間測量腫瘤最長直徑(a)和最短直徑(b)，并計算腫瘤體積(V)：V=ab2/2。

1.2.4 肺轉移灶檢測 各組小鼠肺組織用100 g/l多聚甲醛固定，解剖顯微鏡檢查肺轉移結節數。抑制率為(肺癌模型組中轉移的平均數-實驗組中轉移的平均數)×100%/肺癌模型組平均轉移次數。

1.2.5 血清VEGF檢測 通過人VEGF ELISA試劑盒檢測上清液中VEGF的濃度。根據試劑盒的說明進行，并通過酶標儀選擇492 nm的波長測定。

1.2.6 Western blot檢測 研磨腫瘤組織，并用組織蛋白提取試劑常規提取蛋白質。從每組中取出4 μl蛋白質樣品，并通過BCA方法定量蛋白質以調節蛋白質濃度。將蛋白質樣品與等體積的2×SDS緩沖液混合，加熱變性，通過SDS-PAGE電泳分離上清液，將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。將膜洗滌并在5%牛血清白蛋白溶液中在室溫下封閉1 h。洗滌后，將膜置于一抗稀釋液(兔抗小鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100)中，并在4 ℃溫育過夜。第2天早上洗膜后，將其轉移至二抗稀釋液(堿性磷酸鹽標記的山羊抗兔IgG溶液1∶1000)，在室溫下孵育2 h，顯影。在出現明顯條帶后終止反應，最后使用GIS-2020數字圖像分析系統掃描并分析蛋白質雜交條帶。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠瘤重、肺轉移結節數比較

欖香烯乳組、化療組和聯合組瘤重和肺轉移結節數均較模型組降低(P<0.05)，其中聯合組瘤重和肺轉移結節數明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠瘤重、肺轉移結節數比較

2.2 各組小鼠免疫器官臟器指數比較

聯合組脾臟指數和胸腺指數明顯高于化療組和模型組(P<0.05)，但低于欖香烯乳組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠免疫器官臟器指數比較

2.3 各組小鼠血清VEGF水平比較

模型組、欖香烯乳組、化療組和聯合組血清VEGF分別為(112.24±15.54)pg/ml、(96.46±17.80)pg/ml、(84.03±16.61)pg/ml、(66.72±19.12)pg/ml，欖香烯乳組、化療組和聯合組血清VEGF均較模型組降低(P<0.05)，其中聯合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達比較

聯合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對表達量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達比較

A為模型組；B為欖香烯乳組；C為化療組；D為聯合組。

3 討論

肺癌是臨床預后不良的惡性腫瘤之一，化療在治療中占主導地位，但化療藥物會引起較強的不良反應，其臨床應用因此受限[1]。因此，尋找具有良好抗癌作用和小副作用的藥物是癌癥研究領域的重要方向。中醫藥在肺癌防治中的作用逐漸受到重視，在緩解癥狀，延長生存期，提高治療依從性，減輕和增加療效，抵抗轉移和復發方面具有明顯的優勢[4]。足葉乙甙是細胞周期特異性的抗腫瘤藥物，作用于DNA拓撲異構酶Ⅱ靶點，形成穩定的可逆復合物，可阻斷DNA修復過程，是主要的癌癥化療藥物；順鉑主要作用位點是DNA的嘌呤和嘧啶堿基，使癌細胞的DNA復制過程受到抑制，破壞細胞膜結構，具有抗癌譜廣，作用強的特點，可以和與各種抗腫瘤藥物協同作用，無交叉耐藥的特點[5]。

由足葉乙甙和順鉑組成的EP方案是用于治療小細胞肺癌的標準化療方案，可以有效并廣泛用于臨床實踐。然而，臨床資料顯示，足葉乙甙有更嚴重的不良反應，如嚴重的骨髓抑制、胃腸道反應和肝腎損害等；順鉑的腎毒性和胃腸道反應也很嚴重[6]。欖香烯具有副作用小，耐受性好，可提高治療依從性，并可與化療藥物聯合使用，達到降低毒性和提高療效的效果[7]。本次研究中，各組小鼠瘤重、肺轉移結節數進行比較，欖香烯乳組、化療組和聯合組瘤重和肺轉移結節數均較模型組降低，其中聯合組瘤重和肺轉移結節數明顯低于欖香烯乳組、化療組。說明欖香烯乳聯合足葉乙甙與順鉑化療方案可以顯著抑制肺癌小鼠腫瘤組織的生長過程，抑制癌細胞的轉移和復發。各組小鼠免疫器官臟器指數比較，聯合組脾臟指數和胸腺指數明顯高于化療組和模型組，但低于欖香烯乳組，這表明單獨化療可導致肺癌小鼠脾臟和胸腺萎縮，聯合使用藥物可顯著提高肺癌小鼠的脾指數和胸腺指數，說明欖香烯乳可以在進入人體后保護人體的免疫器官，增強機體的自身免疫功能，從而發揮其降低毒性和提高效率的抗腫瘤作用。

血管內皮生長因子(VEGF)的生物學功能主要是刺激內皮細胞的增殖、促進血管生成和增加微小血管的通透性，可以為腫瘤細胞的生長和血管網絡的建立提供營養物質[8]。VEGF在腫瘤組織中的表達水平與腫瘤微血管密度，惡性程度和轉移程度具有高度的正相關，與患者預后呈負相關[9]。VEGF與其受體結合后，促進肺血管內皮細胞的增殖和遷移，促進血管的形成和生長，加速基底膜的降解，增強血管通透性，促進肺癌的發展[10]。本次研究中，欖香烯乳組、化療組和聯合組血清VEGF均較模型組降低，其中聯合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組，表明欖香烯乳劑可抑制肺癌VEGF的分泌，降低血液中的濃度，減弱其對受體的影響，減緩腫瘤組織中血管內皮細胞的增殖，將欖香烯乳劑與化療聯合對VEGF的分泌抑制作用更強，表明兩者之間存在協同作用。

生物鐘是由身體自我產生的時間節律，不受外部因素的控制，與衰老、代謝紊亂和腫瘤形成密切相關[11]。生物體通過最近的節律調節腫瘤相關基因的表達，并且生物鐘基因的異常表達可能引起節律紊亂，導致腫瘤形成的風險增加[12]。Per2基因是最近節律系統的重要成員，參與調節細胞周期和新陳代謝的多種信號通路。淋巴瘤和白血病組織中Per2蛋白的表達水平顯著低于正常組織，誘導Per2高表達后，腫瘤細胞表現出細胞周期停滯，增殖能力下降和細胞凋亡加速。這些結果表明Per2基因可以抑制腫瘤生長；哺乳動物SIRT1基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白3脫乙酰酶，其與酵母染色質沉默因子2最同源，并具有調節生物代謝的功能[13]。SIRT1可通過去乙酰化與Per2相互作用，在激活SIRT1后，Per2可以發生去乙酰化，并且乙酰化的Per2可以通過磷酸化降解[14]。研究發現SIRT1在腫瘤形成過程中具有致癌和抑癌基因功能，其關鍵作用是維持致癌基因和抑癌基因之間的平衡[15]。

本次研究中，各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達比較，聯合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對表達量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組。推測欖香烯乳抑制 Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長的作用機制可能與生物鐘基因 Per2和SIRT1的表達被激活有關，且欖香烯乳聯合化療更能促進腫瘤組織中 Per2 和 SIRT1 蛋白的表達，在臨床上治療肺癌的效果可能會更好。

綜上所述，欖香烯乳聯合化療對Lewis肺癌有較好的抑瘤作用，可能與免疫調節、VEGF下調，促進Per2/SIRT1蛋白表達有關。