下調HOXA5表達對膠質瘤細胞增殖能力和細胞周期的影響

徐修鵬 季 晶 劉 寧 李海林 路 華

膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，具有多種惡性生物學表型，如惡性增殖能力強、易向周邊腦組織侵襲和放化療抵抗等[1]。近年來，盡管膠質瘤的綜合治療取得了一定程度的進展，但病人中位生存期卻未明顯延長，部分歸因于膠質瘤的惡性增殖能力[2]。因此，探索膠質瘤惡性增殖能力的分子調控機制，有助于開發更有效的治療措施。

同源框基因家族在進化上高度保守，參與調控胚胎發育和細胞分化[3]。同源異型盒基因A5（homeobox gene A5，HOXA5）是同源框基因家族中的一員，既往研究顯示HOXA5在多種惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤的多種惡性生物學表型密切相關[4]。本文探討HOXA5 在膠質瘤中的表達及其對膠質瘤增殖能力和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 生信分析 計算機檢索中國膠質瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA；http://www.cgga.org.cn）。從mRNAseq-693 和mRNAseq-325 芯片中獲取HOXA5 mRNA 在低級別膠質瘤（WHO 分級Ⅱ級）和高級別膠質瘤（WHO 分級Ⅲ、Ⅳ級）中的表達及相應的病人生存信息。在高級別膠質瘤中，以HOXA5表達水平的平均值為界限，分為低表達組和高表達組，Kaplan-Meier 法分析HOXA5 表達水平與高級別膠質瘤病人預后的關系。

1.2 膠質瘤U87、U251細胞培養、轉染及分組U87和U251 細胞（中國科學院細胞庫）置于含10%胎牛血清DMEM中培養并傳代。取對數生長期膠質瘤細胞種植于6孔板中，待細胞匯合度達到75%左右時，參考Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）說明書轉染siRNAs。細胞分組兩組：陰性對照組（轉染siRNA-ctrl）和敲低組（轉染siRNA-HOXA5）。36 h后收集細胞，提取總蛋白，驗證干擾效率，并用于后續的生物學實驗。

1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖率 取對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔1 000個細胞。0、1、2、3、4 d，每個孔加入10 μl CCK-8 檢測液（日本Dojin do 公司），37.3 ℃孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度值，計算細胞存活率。各組細胞設置5個副孔。

1.4 平板克隆實驗檢測細胞克隆集落形成能力 將膠質瘤細胞接種于直徑6 cm 的培養皿中，每個皿接種300 個細胞，并加入4 ml 培養基充分混勻，放入37.3 ℃恒溫培養箱中培養12 d，棄培養液，4%多聚甲醛固定2 h后用結晶紫染色。回收結晶紫染液，用清水沖洗后晾干、拍照、計數克隆數量，每組重復三次。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期 將膠質瘤細胞接種于6孔板中，每孔約40 000個細胞，培養36 h后，每孔加入1 ml 不含EDTA 的胰酶溶液消化細胞，至顯微鏡下細胞變圓，輕震板底約半數細胞飄起時加入2 ml 完全培養基終止消化，移液槍將細胞吹打成細胞懸液。離心后獲得細胞沉淀，用PBS 洗滌一次后再次離心，棄洗滌液，加入-20 ℃冰箱預冷的75%酒精吹打混勻，固定。按照細胞周期檢測試劑盒（中國聯科生物公司）操作步驟，上機完成細胞周期檢測，每組重復三次。

1.6 免疫印跡法檢測細胞HOXA5 及周期相關蛋白的表達 根據凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白和組織蛋白，選用凱基BCA 試劑盒測定蛋白濃度，并用上樣緩沖液配平。蛋白變性后，按每孔20 μl 上樣，經10%SDS-PAGE 電泳后轉移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗滌3 次后，加入二抗，室溫搖床孵育2 h，洗滌3次后，加入曝光液曝光，拷貝條帶，以β-actin為內參，Image J軟件行灰度分析。

1.7 統計學分析 采用GraphPad軟件進行分析；定量資料采用±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤HOXA5 的表達CGGA 數據庫分析結果顯示：與低級別膠質瘤相比，高級別膠質瘤HOXA5 mRNA表達水平顯著增高（P＜0.01，圖1）。

圖1 不同病理級別膠質瘤HOXA5表達水平比較

2.2 HOXA5 表達水平與高級別膠質預后的關系 生存分析結果顯示：低表達組高級別膠質瘤病人中位生存時間較高表達組明顯延長（P＜0.01，圖2）。

圖2 生存曲線分析HOXA5表達水平與高級別膠質瘤病人生存預后的關系

2.3 敲低HOXA5 表達對膠質瘤細胞增殖能力的影響siRNA-HOXA5 組細胞HOXA5 蛋白表達水平顯著低于siRNA-ctrl 組（P＜0.01，圖3）。與siRNA-ctrl組相比，siRNA-HOXA5組細胞增殖率和克隆形成能力均顯著降低（P＜0.01，圖3）。

圖3 敲低HOXA5表達抑制膠質瘤U87和U251細胞增殖

2.4 敲低HOXA5 表達對細胞周期及細胞周期相關蛋白表達的影響 流式細胞周期檢測結果顯示：siRNA-HOXA5 組細胞G0/G1 期細胞百分比較siRNActrl組顯著增加（P＜0.01，圖4）；而且，siRNA-HOXA5組細胞CDK4表達水平較siRNA-ctrl組顯著減少（P＜0.01，圖4）。

圖4 敲低HOXA5表達對膠質瘤U87和U251細胞周期及周期相關蛋白表達的影響

3 討論

本研究結果顯示：膠質瘤HOXA5 呈高表達；HOXA5 高表達組高級別膠質瘤病人生存預后較低表達組要差。這表明，HOXA5在膠質瘤中可能發揮促癌作用，并有可能成為膠質瘤潛在的診斷標記物和治療靶點。

既往研究表明，HOXA5的異常表達與多種腫瘤的發生與發展密切相關，例如，乳腺癌HOXA5 表達缺失促進乳腺癌的發生與發展[5～7]。進一步機制研究表明，乳腺癌HOXA5基因表達缺失與其啟動子高度甲基化有關[8]。這些研究表明HOXA5在乳腺癌中發揮抑癌基因作用。與之相反的是，HOXA5在食管癌組織中高表達，并且高表達的HOXA5可以通過激活wnt/β-catenin信號通路促進食管癌細胞的上皮間質亞型轉換[9]。這些研究結果表明，HOXA5 在食管癌中發揮促癌的作用。為了探討HOXA5 對膠質瘤增殖能力的影響，我們使用siRNA 敲低膠質瘤細胞HOXA5的表達水平，結果顯示，敲低HOXA5表達可以顯著降低膠質瘤細胞體外增殖能力。

細胞周期是調控細胞增殖的基礎生命進程，這一進程主要受細胞周期相關蛋白調控[10]。本研究結果顯示，敲低膠質瘤細胞HOXA5 的表達，明顯降低CDK4 表達水平，使膠質瘤細胞周期阻滯于G0/G1期。近期有文獻報道，HOXA5可以通過激活wnt/βcatenin 信號通路促進腫瘤細胞的惡性生物學表型，包括細胞增殖和細胞周期[9]。但是，HOXA5 是否可以通過影響活wnt/β-catenin信號通路進而影響膠質瘤細胞增殖和細胞周期，有待進一步研究。

目前，引起膠質瘤HOXA5表達水平升高的機制尚不明確。已有研究表明，microRNA介導的轉錄后調控機制在調節HOXA5 表達中發揮重要作用。例如，microRNA-196a 可以通過抑制肺癌HOXA5 表達，進而促進肺癌細胞增殖與侵襲[11]。另有文獻報道，乳腺癌中視黃酸可以通過泛素化降解c-myc，從而抑制microRNA-130a的表達，進而促進HOXA5的表達[12]。但是，膠質瘤HOXA5高表達是否是由相關microRNA表達異常引起，還需要進一步的驗證。另外，有研究表明，HOXA5 基因啟動子區甲基化與胃癌HOXA5 低表達有關[13]。因此，我們推測，膠質瘤高表達的HOXA5 可能與其啟動子區低甲基化水平有關。

綜上所述，靶向抑制膠質瘤HOXA5的表達可以顯著降低膠質瘤細胞體外增殖能力，抑制CDK4 蛋白的表達，抑制細胞周期從G0/G1 期向G2/S 期轉換。這提示HOXA5 在膠質瘤中發揮促進腫瘤增殖和細胞周期的作用，并有望成為膠質瘤分子靶向治療的新靶點。