細(xì)胞內(nèi)源miRNAs影響副黏病毒功能研究進(jìn)展

鐘純燕 李基棕 保丹東 楊 斌 趙慶亮 盧 梅 譚 艷 主 性

1.黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州興義562400；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)5500252；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京210014；4.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；5.貴州省望謨縣大觀鎮(zhèn)人民政府，貴州望謨552305

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度19～24 nt，它的種子區(qū)在進(jìn)化上高度保守，轉(zhuǎn)錄后可以引發(fā)基因沉默或影響細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，在細(xì)胞分化、代謝、增殖及凋亡的各個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用，并參與腫瘤形成、生殖發(fā)育及病毒感染等過(guò)程。研究表明，成熟的miRNAs 被RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）識(shí)別后，與靶mRNA 堿基互補(bǔ)結(jié)合，降解mRNA 或抑制mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)功能。總的來(lái)說(shuō)，一種miRNA 調(diào)節(jié)的靶基因可超過(guò)100 種，并且一半以上的轉(zhuǎn)錄物能被2 個(gè)以上miRNAs 協(xié)同調(diào)節(jié)，形成龐大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，因而對(duì)于miRNAs 靶基因的研究以及miRNAs 造成的生物學(xué)功能的影響值得我們深入探索。在2000年，黃元桐在《一種新的病毒病——尼帕病毒腦炎》中提出尼帕病毒（NiV）屬于副黏病毒亞科的亨尼帕病毒屬的成員[1]，自此以后有研究報(bào)道細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)NiV 功能的影響，從而拉開了細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)副黏病毒功能研究的篇章。

副黏病毒是一類單股負(fù)鏈RNA 病毒，病毒顆粒呈多形性，有囊膜及纖突，核衣殼為螺旋狀對(duì)稱，可分為副黏病毒亞科和肺病毒亞科，主要成員包括副黏病毒屬、麻疹病毒屬、腮腺炎病毒屬及肺病毒屬。副黏病毒能在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體、合胞體，對(duì)細(xì)胞有吸附作用，因此展開細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)副黏病毒功能的研究顯得尤為重要。目前已有研究表明，細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 參與調(diào)節(jié)副黏病毒感染、增殖及細(xì)胞分裂、腫瘤形成等眾多環(huán)節(jié)。因此，本文全面總結(jié)了細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 影響副黏病毒致病作用及其功能體現(xiàn)，為進(jìn)一步闡明副黏病毒在宿主體內(nèi)的致病機(jī)制提供新的方向。

1 細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 在副黏病毒免疫反應(yīng)中的作用

干擾宿主細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是副黏病毒為了在宿主體內(nèi)生存，在進(jìn)化過(guò)程中形成的逃避機(jī)體免疫的一種能力。感染副黏病毒后宿主細(xì)胞會(huì)以各種方式來(lái)防御病毒的入侵，如分泌不同活性的小分子蛋白——細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)。miRNAs 在IFN 和干擾素刺激基因（ISGs）的調(diào)節(jié)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，其信號(hào)通路中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)都可能作為miRNAs 的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒（SV）可作為IFN 的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，感染SV后通過(guò)IFN 處理，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-203 在感染細(xì)胞中能夠發(fā)生積累；Li 等[2]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-466l 可直接靶向IFN-α 的表達(dá)來(lái)抑制宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答；Ingle 等[3]提出病毒RNA 的胞漿感受器——維甲酸誘導(dǎo)基因-I 樣受體（RIG-I like receptors，RLRs）的激活可誘導(dǎo)抗病毒的免疫應(yīng)答，miR-485在感染新城疫病毒（NDV）的細(xì)胞內(nèi)可直接靶向RIG-I 的mRNA 并將其降解，使NDV 實(shí)現(xiàn)免疫逃避，從而提高NDV 的復(fù)制水平。以上研究結(jié)果表明，miRNAs 在感染副黏病毒的細(xì)胞中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。

在麻疹疫苗的體液免疫中，MiR-5P、miR-223、miR-29、miR-15a-5P、miR-199a-3p、miR-103a 和miR-15a 有著直接或間接的影響，由此研究人員還提出miRNAs 可以作為疫苗體液免疫應(yīng)答的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。Foo 等[4]報(bào)道稱miRNAs 可以作為靶分子來(lái)促進(jìn)病毒的增殖，并報(bào)道稱miR-181 與miR-17～93 家族的成員對(duì)亨德拉病毒（HeV）的感染起促進(jìn)作用，而這主要是過(guò)表達(dá)miR-181 能夠抑制調(diào)節(jié)因子EphB 4、EPHA 5、EphA 7 的表達(dá)，檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)miR-181 在感染HeV 的雪貂和馬的體液中水平上調(diào)。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)高通量測(cè)序分析探討了山羊副流感病毒3 型（CPIV3）接種MDBK 細(xì)胞的miRNAs 表達(dá)譜變化，鑒定了差異表達(dá)顯著的249 個(gè)已知miRNAs 和152 個(gè)新miRNAs，靶基因預(yù)測(cè)與功能分析發(fā)現(xiàn)這些miRNAs 參與調(diào)控CPIV3 的復(fù)制及宿主細(xì)胞的先天免疫應(yīng)答。以上結(jié)果均表明miRNAs 在副黏病毒的免疫反應(yīng)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

2 細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 在細(xì)胞分裂與細(xì)胞凋亡中的作用

麻疹病毒（MV）除感染多種淋巴和非淋巴外周器官外，還會(huì)持續(xù)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）細(xì)胞。研究[5]表明，miR-124 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具特征的miRNAs 之一，在感染MV 的分化型神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)腫瘤細(xì)胞中miRNA-124 表達(dá)升高，周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）表達(dá)減少。外周血淋巴細(xì)胞（PBL）感染MV 后，CDK6 表達(dá)降低從而引起了細(xì)胞周期阻滯，使PBL 表現(xiàn)出分裂和凋亡低敏感性的特征；因此，研究者們大膽提出MV 能持續(xù)感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞是由miR-124 下調(diào)CDK6 表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，這是首次研究報(bào)道m(xù)iRNAs 對(duì)MV 的持續(xù)感染機(jī)制。以上結(jié)果揭示了宿主miRNAs 在CNS 衍生細(xì)胞中誘導(dǎo)MV 持續(xù)感染的作用機(jī)制，為預(yù)防或解決病毒持續(xù)感染提供新的分子靶點(diǎn)。

研究者還發(fā)現(xiàn)5 種NDV 結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)NAs 以RNAi 技術(shù)進(jìn)行靶向和敲除，得出感染NDV 雞成纖維（DF-1）細(xì)胞中的NP mRNA 含量能被過(guò)表達(dá)miR-NP 而降低，而且過(guò)表達(dá)miR-NP 還能抑制NDV 在細(xì)胞中的增殖水平和降低細(xì)胞死亡[6]。此研究為動(dòng)物機(jī)體抵御NDV 感染提供了新的科學(xué)思路。

3 細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)腫瘤生成的影響

溶瘤病毒包括腺病毒（Adenovirus）、呼腸孤病毒（RV）、NDV 和MV 等病毒，MV 是一種新型的具有抗腫瘤活性的溶瘤病毒。MiRNAs 調(diào)控脊髓灰質(zhì)炎病毒受體4（PVRL4）研究中揭示了MV 抗腫瘤的作用機(jī)制，是miR-31 和miR-128 的靶向PVRL4，過(guò)表達(dá)miR-31/128 能降低MV 的感染，抑制表達(dá)miR-31/128 則提高M(jìn)V 的增殖。以上結(jié)果表明，miR-128 和miR-31 靶向PVRL4 調(diào)節(jié)MV 的復(fù)制和感染，達(dá)到增強(qiáng)MV 抗腫瘤作用的目的。將合成的miRNAs 插入MV 基因組中，建立miRNAs 靶位點(diǎn)（miRTS）植入靶向系統(tǒng)，結(jié)果表明，插入miR-122、miR-148a 或miR-7 后，在細(xì)胞株、肝片和原代人肝細(xì)胞中MV-EGFP（MTD）的復(fù)制受到抑制，表明了miRNAs 在胰腺癌模型中對(duì)腫瘤的生成有重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)[7]miR-7 通過(guò)抑制MV 包膜蛋白的翻譯，從而限制病毒的傳播和子代病毒的產(chǎn)生，影響異種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生成。以上結(jié)果均表明miRNAs 對(duì)腫瘤生成具有重要的影響。

4 細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)副黏病毒的其他功能

細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 在副黏病毒的功能基因組學(xué)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)方面均有作用。2017年研究報(bào)道在HeV 和NiV 的感染和疾病中，利用RNAi 技術(shù)沉默miRNAs 靶基因，對(duì)探索免疫調(diào)節(jié)劑和宿主核蛋白具有重要意義。SV 的miRNAs熒光檢測(cè)系統(tǒng)能對(duì)miRNAs 在細(xì)胞重編程過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。攜帶4 種重編程因子（SeVdp-iPS）的SV 載體對(duì)轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSCs）的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用，而miR-302 對(duì)SeVdp-iPS 載體的影響使其只能在IPSCs 中表達(dá)，這就預(yù)示SeVdp-iPS載體可能成為產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的工具在將來(lái)應(yīng)用于臨床。

5 展 望

近年來(lái)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 影響副黏病毒的機(jī)制研究主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)病毒生命周期、促細(xì)胞存活、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等方面，靶對(duì)象主要集中在人的MV、SV、HeV 和NiV 上，關(guān)于細(xì)胞內(nèi)源miRNAs對(duì)動(dòng)物感染副黏病毒的研究目前限于CPIV3 和NDV 的報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)大多數(shù)副黏病毒，如犬瘟熱病毒（CDV）及小反芻獸疫病毒（PPRV）等的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。由于此類病毒宿主廣泛，被感染的動(dòng)物常出現(xiàn)呼吸道和消化道疾病，造成較高發(fā)病率和死亡率，因此，進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)副黏病毒的功能，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。隨著全面而深入的剖析細(xì)胞內(nèi)源miRNAs 對(duì)病毒的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞內(nèi)的miRNAs 將有望應(yīng)用于抗腫瘤、抗病毒感染以及基因治療的有效工具。