未明原因嬰兒肝內膽汁淤積癥中SLC25A13基因變異特征

方玲娟，林小春，徐彰，黃開宇，陳檜平，閆秀梅

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童消化科，浙江 溫州 325027

Citrin缺陷?。–itrin deficiency, CD）由SLC25A13基因變異導致編碼Citrin蛋白缺失和功能異常引起的一種常染色體隱性遺傳性疾病。臨床上主要包含CD缺陷所致的新生兒肝內膽汁淤積癥（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency, NICCD）[1]、CD所致的生長發育落后和血脂異常（failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency, FTTDCD）[2]和成人發病瓜氨酸血癥II型（adult-onset type II citrullinemia, CTLN2）[3]三種類型[4]。

NICCD是一種泛種族疾病，尤其以東南亞國家多見，我國多省市均有NICCD的報道，各地發病率、SLC25A13基因變異特征及攜帶率均存在一定的差異。迄今為止，浙江省關于嬰兒肝內膽汁淤積癥中SLC25A13基因變異的相關文獻僅有3篇，共報道了6例NICCD患兒，其中1例合并膽道閉鎖。本研究分析溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院就診的未明原因嬰兒肝內膽汁淤積癥中SLC25A13基因的變異特征，了解本地區的疾病譜特征，為臨床診療提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年1月至2020年12月在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院兒童消化科住院的未明原因嬰兒膽汁淤積癥病例。納入標準：①年齡小于1歲；②結合膽紅素升高（血清總膽紅素高于85 μmol/L，結合膽紅素占總膽紅素的20%以上；或者血清總膽紅素低于85 μmol/L，結合膽紅素大于17 μmol/L）。排除標準：①除外肝外膽道疾病，包括膽道閉鎖、膽道囊腫或腫瘤等；②除外持續谷氨酰轉肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）低于50 U/L和（或）總膽汁酸（total bile acid, TBA）低于10 μmol/L；③除外感染（包括細菌感染，如尿路感染、敗血癥等，以及血清學陽性病毒感染，如弓形蟲、風疹病毒、EB病毒、單純皰疹病毒、HIV、梅毒螺旋體感染等），但未排除巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染患兒，因為CMV感染在嬰兒中常見，感染后其預后與未感染患兒無明顯差異，且存在CMV感染并不能排除其他病因，尤其是遺傳性病因；④排除甲狀腺功能低下、靜脈營養史等。

1.2 方法 經溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院倫理委員會批準，并經患兒家屬簽署知情同意書后，留取患兒及其父母親的外周EDTA抗凝血 2 mL，抽提基因組DNA。先證者基因組DNA樣本進行二代測序（包括膽汁淤積性肝病Panel或者全外顯子組測序），并加測SLC25A13基因常見的兩個大片段熱點變異位點c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb。再根據二代測序檢測結果，對患兒及其父母DNA標本進行SLC25A13基因Sanger測序驗證。

1.2.1 二代測序（next generation sequencing, NGS）及一代驗證：采用液相捕獲試劑盒捕獲，通過NGS儀IlluminaHiSeq 2000（美國Illumina公司）完成高通量測序，測序平均深度不小于200。根據所得數據，進行基因序列生物信息學分析，發現的變異位點再進行一代測序驗證。此部分分別委托北京邁基諾基因檢測公司和北京金準基因檢測公司完成。

2.3 新發變異L603P的致病性分析 該變異位點位于SLC25A13基因的第17號外顯子，通過檢索中國知網、萬方、PubMed等數據庫，均未見文獻報道，為新發現的變異位點。通過檢索多個人類遺傳變異體數據庫，發現該位點在不同地區不同人群中的等位基因變異頻率極低：在千人數據庫中為0；在EXAC數據庫中不同人群中均為0；在GnomAD數據庫中東亞和南亞人群為0，歐洲人群中則為1.8/10萬。對該變異位點氨基酸保守性分析顯示此位點氨基酸在不同物種間具有高度保守性，見表2。另外，多個變異功能預測軟件分析均顯示該位點變異為致病性變異。具體如下：在Mutation Taster分析中顯示該位點變異可顯著影響功能，為致病性變異，其分值為0.871（分值越接近1，功能影響越大）；在SIFT分析中顯示為有害變異，分值＜0.001（＜0.05提示為有害變異）；在Provean分析中提示為有害變異，分值為-6.73（≤-2.5提示為有害變異）；在Polyphen2分析中提示為有害變異，分值為0.832（＞0.8提示為有害變異）；在M-CAP和CADD分析中均提示為致病性變異，分值分別為0.304（＞0.025提示為致病性）和28.2（＞20提示為致病性）。

2.2 基因檢測結果 30例中10例進行了膽汁淤積性肝病Panel檢測（包含SLC25A13基因），18例進行了全外顯子檢測，另有2例直接進行SLC25A13基因全部外顯子檢測。同時所有病例都加測了中國人群中常見的大片段變異位點c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測。共發現12例患兒攜帶SLC25A13基因變異，其中2例純合變異，5例復合雜合變異，5例雜合變異，見表1。SLC25A13基因的總檢出率為40%（12/30）。在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測到存在SLC25A13基因致病性變異，其中2例純合、4例復合雜合以及2例雜合。還有4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因致病性變異，包括1例復合雜合變異和3例雜合變異。另外3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異。共檢測到19個致病性變異位點，7個不同的變異類型，包括中國人群中最常見的4個致病性變異，分別為c.852_855delTATG，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb，以及2個次常見致病性變異c.1177+1G＞A和c.1399C＞T，同時發現一個未報道的新發變異位點c.1808T＞C，p.L603P。其中c.852_855delTATG占總檢出致病性變異的52.63%（10/19），c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出致病性變異的10.53%。4個常見致病性變異占總檢出致病性變異的84.21%（16/19），4個常見致病性變異和2個次常見致病性變異占總檢出致病性變異的94.73%。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件對數據進行分析。計數資料用百分比表示，組間兩兩比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.1 一般資料 共30例未明原因嬰兒肝內膽汁淤積癥患兒納入本研究，其中男18例，女12例。除1例患兒父母為近親婚配外，其余所有患兒的父母均非近親。其中29例患兒進行了血氨基酸質譜檢測，發現8例瓜氨酸升高伴或者不伴其他氨基酸升高（如甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸），3例甲硫氨酸升高，1例酪氨酸升高，另外17例未見明顯氨基酸代謝異常。

1.2.3 判讀方法：測序結果利用SeqScape 2.0軟件進行分析，然后利用DNAMAN5.1.5軟件（LynnonBiosof，美國）與SLC25A13基因序列（Ensembl Genome Browser：ENSG0000004864）進行比對。變異類型根據人類基因組變異學會（http://varnomen.hgvs.org/）標準進行命名。致病性分析根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）發布的序列變異的解釋標準指南進行[5]。SLC25A13基因Ensembl參考序列為ENSG00000004864，Genbank參考序列為NM_014251.3。編碼的氨基酸Ensembl參考序列為ENSP00000265631.1，Genbank參考序列為NP_055066.1。檢測到的變異通過檢索PubMed、HGMD、ClinVar等在線數據庫進行比對。已知的致病性變異、經典剪接位點變異、無義和框移變異均被認為是致病的。對新發的錯義變異分別進行人群變異頻率分析、氨基酸同源性分析、變異功能預測分析等，以確定其致病性。

2.4 瓜氨酸代謝異常與基因譜的相關性 在12例檢測到SLC25A13基因變異的患兒中，共8例入選瓜氨酸血癥組，3例入選非瓜氨酸血癥組。另外1例由于血氨基酸檢測時患兒膽汁淤積癥已完全緩解，轉氨酶恢復正常，參考意義不大，故不適合入組分析。對比瓜氨酸血癥組和非瓜氨酸血癥組中的基因變異類型，發現2組基本以非錯義變異為主，基因變異類型差異無統計學意義（P＞0.05）；比較2組間等位基因變異數量，發現瓜氨酸血癥組中等位基因變異的數量顯著高于非瓜氨酸血癥組，差異有統計學意義（P=0.001）。

美國、加拿大、澳大利亞等國制定并完善了礦業生態補償相關措施。例如美國的“濕地融資計劃”，澳大利亞的“環境凈收益計劃”，加拿大要求礦業主與政府簽署“損益協議書”，做好利益分配和生態補償[13]。同時還著重對廢棄礦山進行改造，發展礦山公園和礦業旅游。

國家政府應該加大對女性就業的政策幫扶，通過政治手段和法律手段規范就業體制，完善對女性就業的權益保護；社會要發揮媒體的宣傳效應，加大對女性就業的正面宣傳，引導女大學畢業生更加自信更加清楚的面對社會客觀形式，提高自身能力，保持清醒的意識，客觀擇業。各應聘單位一定要客觀公平公正公開的進行合法招聘，避免性別歧視和人為設置“就業壁壘”，根據理工科女大學畢業生的特點為她們設定一批能夠發揮她們自身最大商業價值的競聘崗位。

2 結果

證明 定義如下：對任意x ∈ X, = (x → 1) → 1).首先證明是X的猶豫模糊濾子.顯然， ? 對任意x ∈ X都成立，即(HF1)成立.對任意x,y ∈ X, 由命題1.1和引理2.1知，

1.2.2 熱點變異c.1638_1660dup23bp和IVS16ins3kb的檢測：①位點c.1638_1660dup23bp：這是一段23 bp序列的重復，在該位點的兩端設計引物（F：CAGGAGAGGCATGGTTGCATTTCCC；R：GACTTAC GAATTGCTACAGCGATGG），PCR片段長度為480 bp，用普通PCR進行擴增再送去一代測序即可。目標區域序列為GAGATTACAGGTGGCTGCCCGGG，如樣本沒有出現23 bp的重復，判定為野生型（negative），反之則為變異型（positive）。②位點IVS16ins3kb：這是一段3 kb的片段插入變異，在該位點的兩端設計引物（F：GGAGCAGACATCTTGCACAC；R：TGATGAGAATG TATCAACTCC），如果有插入，PCR之后會出現大于 3 kb的條帶；如果沒有插入，結果只有703 bp的條帶。為了確認這一結果，再對PCR產物片段偏大的樣本進行一代測序，如果樣本出現了3 kb的堿基插入，判定為變異型（positive）。

企業在資金使用的過程中，需要進行嚴格的科學論證，不能盲目擴大規模，防止資金斷流，讓企業陷入經營困境。對于中小型餐飲企業而言，提升企業自身經營實力，發展品牌效益，是企業可持續發展的一個關鍵因素。

不錯，簡東亮是李若的房東，當初李若到廣州來打拼的時候，發現房租貴得要命，她繞來繞去地找朋友，就租到了簡東亮的房子。他貸款買的50平的兩居室，月供要還20年，路漫漫其修遠兮，出租個房間給李若也是為了緩解一下房貸壓力。

3 討論

SLC25A13基因變異所致NICCD在新生兒期及嬰兒早期常表現為血氨基酸異常，尤其以瓜氨酸血癥為最典型[6-7]。通常為了提高SLC25A13基因變異篩查效益，多以血氨基酸明顯異常作為主要篩選指標，進行高頻致病性變異的篩查[2，6，8-9]。本研究中在8例存在明顯瓜氨酸血癥的病例中均檢測到存在SLC25A13基因變異，可見瓜氨酸血癥在NICCD病例中具有高度特征性，是臨床識別NICCD的重要指標，與既往研究[6]一致。本研究中3例血甲硫氨酸升高和1例血酪氨酸升高的患兒均未檢出到SLC25A13基因變異，與既往研究[6]不一致。另外，本研究中4例雖然不存在血氨基酸代謝異常，仍檢出SLC25A13基因變異，提示對于臨床不存在氨基酸代謝異常的膽汁淤積病例需要保持警惕，要考慮NICCD的可能性，以免發生漏診，延誤診治。另外，本研究發現瓜氨酸血癥患兒中等位基因變異的數量明顯高于非瓜氨酸血癥患兒，提示等位基因變異數量越多對Citrin蛋白功能影響越大，故越易導致臨床上出現瓜氨酸血癥。近幾年，多個研究[6，10-12]表明， 雖然瓜氨酸血癥在NICCD中具有特征性，但是在新生兒期以及嬰兒期仍然存在血氨基酸代謝篩查陰性的NICCD患兒，這部分病例容易誤診、漏診，對于缺乏典型臨床表現的病例，需考慮采用NGS進行基因檢測。

研究發現日本最常見的致病性變異類型是c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[13]，而韓國人群中最常見的致病性變異類型是IVSl6ins3kb、c.852_855delTATG和c.1177+1G＞A[14]。LIN等[10]報道的中國人群中最常見致病性變異為：c.852_855delTATG（58.33%）、IVSl6ins3kb（10.04%）、c.1638_1660dup（8.52%）、c.615+5G＞A（7.58%），且存在地區差異，c.852_855delTATG在南方高，北方低，而IVSl6ins3kb在南方低，北方高?；蜃儺惖牡貐^差異可能與人種遷移及祖先來源有關。本研究先證者中檢出的變異類型中，以4種高頻變異最常見，其中c.852_855delTATG占總檢出變異的52.63%，c.1638_1660dup23bp，c.615+5G＞A和IVS16ins3kb均占總檢出變異的10.53%，與LIN等[10]的研究相一致，本研究中的病例來源于溫州，溫州地處浙南地區，位于北回歸線以南，變異特征與地理區域分布相吻合。國內報道了多個不同地區關于SLC25A13基因變異研究，從中國北部到中國南部，從中國東部到中國西部，c.852_855delTATG變異在總變異中的頻率為46.57%～58.33%，可以看到該變異占絕對優勢，近半數的病例攜帶c.852_855delTATG變異。LU等[13]報道中國正常人群中c.852_855delTATG等位基因攜帶率為1.08%（45/4169），對于我國龐大的人口基數來說，c.852_855delTATG變異位點攜帶者數量相當可觀，需要重視，尤其是有關優生優育方面，減少或避免遺傳代謝病嬰兒的出生。

本研究是溫州地區，乃至浙江地區首個CD的隊列研究，SLC25A13基因變異總檢出率為40%，提示Citrin缺陷是嬰兒肝內膽汁淤積癥中的重要病因，亦是嬰兒肝內膽汁淤積癥中居首位的遺傳性代謝性病因。隨著對CD的認識逐步加深，研究的進一步深入，新發變異逐步被發現。本研究檢測到一個新發變異c.1808T＞C，p.L603P，該變異位點為罕見變異位點，變異功能預測分析提示為致病性變異，新變異的發現豐富了SLC25A13基因變異譜。以上發現為NICCD確診提供了可靠依據，也為相應家庭的遺傳咨詢和產前診斷提供了科學依據。

本研究的不足之處在于3例患兒存在SLC25A13基因單個雜合變異，且未提示存在明顯瓜氨酸血癥，無法確診NICCD。本研究僅對已知常見的大片段的插入或缺失變異進行檢測，可能遺漏罕見、未報道到的，甚至是內含子區域的大片段的插入或缺失變異。另外，對于新發現的變異，僅進行變異功能預測，未進行體外功能研究，未來可以對新變異的功能改變進一步進行研究。

SLC25A13基因變異所致CD是未明顯原因嬰兒肝內膽汁淤積癥中居首位的遺傳代謝性病因，以c.852_855delTATG，p.M285Pfs*2為最常見變異類型。新發現的變異位點豐富了SLC25A13基因的變異譜。