泰山白首烏內生真菌多樣性及其抗腫瘤活性研究

馮坤苗，吳思佳，陳文華，代 威，徐凌川，韓 婷 （. 海軍軍醫大學藥學院, 上海 004；. 浙江中醫藥大學藥學院, 浙江 杭州 005；. 山東中醫藥大學藥學院, 山東 濟南 5099）

泰山白首烏來源于為蘿摩科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬（CynanchumLinn.）植物戟葉牛皮消Cynanchum bungeiDecne. 的干燥塊根，《本草備要》記載：“具有養血補血、補肝腎、強筋骨和潤腸通便的作用”，也被譽為泰山四大名藥之首[1-2]。研究表明，泰山白首烏的主要活性成分為苯乙酮和C21甾體皂苷[3-7]。泰山白首烏的主要藥理活性有抗腫瘤、保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁、降血糖 等[5-7]。

植物內生菌是一類廣泛存在于宿主植物體內，且不引起宿主明顯病癥的真菌，是一類具有豐富多樣性的微生物類群。植物內生菌通過“協同進化”作用，以促進宿主植物生長，增強抗逆性，促進藥用植物中有效成分的積累[8-9]，植物內生菌已成為國內外學者的研究熱點。顧曉潔等[10]2018 年報道了濱海白首烏塊根中內生細菌的分離鑒定。Li 等[11]從濱海白首烏中分離出的一株產紅色素具有抗氧化作用的內生真菌Stemphylium lycopersici。Gu 等[12]從濱海白首烏中分離得到的內生真菌Plectosphaerella cucumerinaYCTA2Z1 中分離鑒定得到13 種化合物，分離得到與宿主濱海白首烏相同的次級代謝產物單體告達庭（caudatin）、白首烏二苯酮、cynandione B 和 2',5'-二羥基苯乙酮[11-12]。但是，目前沒有關于泰山白首烏內生真菌的傳統分離純化培養報道。同時，有研究表明，泰山白首烏的粗提物和單體化合物對多種腫瘤細胞株均具有顯著活性[6]，目前已有從植物中分離得到具有抗腫瘤活性的內生真菌[13-14]的研究，但對泰山白首烏內生真菌的相關分離鑒定、活性成分及抗腫瘤等生物活性的研究還未開展。

本實驗以泰山白首烏內生真菌為研究對象，通過傳統分離培養法，將分離鑒定得到的泰山白首烏內生真菌進行液體發酵，并進行抗腫瘤活性菌株篩選。一方面探討泰山白首烏內生真菌能否產生與宿主相似的次級代謝產物，另一方面為研發新的抗腫瘤活性藥物提供科學依據。

1 材料

1.1 藥用植物

3 個產地的健康泰山白首烏植株各5 株，包含根、莖、葉。濟南的泰山白首烏葉（JTY）、泰山白首烏莖（JTJ）、泰山白首烏根（JTG），均采自山東中醫藥大學長清校區植物園內（36°56′ N, 116°79′ E）；臨沂的泰山白首烏葉（LTY）、泰山白首烏莖（LTJ）、泰山白首烏根（LTG），均采自臨沂費縣御華景宸農業生態園內（35°27′ N, 117°97′ E）；泰安的泰山白首烏葉（TTY）、泰山白首烏莖（TTJ）、泰山白首烏根（TTG），均采自泰山（35°78′ N, 117°45′ E）。植物樣品經山東中醫藥大學中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為泰山白首烏C. bungeiDecne.。采集的樣品用無菌塑料袋包裝，置于4 ℃冰箱保存備用，48 h 內進行樣品處理。

1.2 儀器與試劑

T100?梯度PCR 擴增儀（美國BIO-RAD 伯樂T100 梯度PCR 儀）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；Qubit? 2.0 熒光計（賽默飛Invitrogen）；SW-CJ-1D 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；E.Z.N.A.真菌DNA 提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek）；Taq DNA Polymerase（ 賽默飛 Thermo） ； Agencourt AMPure XP（Beckman）；2×Trans Taq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix I（北京全式金生物技術有限公司）；ddH2O（北京全式金生物技術有限公司）；瓊脂糖（超純）（北京天根生物科技有限公司）；50×TAE 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司Solarbio）；DNA Maker（日本TaKaRa）；Goldview 核酸染料（10 000×）；6×Loading buffer（日本TaKaRa）；XD-101 CO2細胞培養箱（日本SANYO 公司）；奧林巴斯IX51 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司OLYMPUS） ； ELX800 光吸收酶標儀（ 美國BioTek）；細胞培養瓶（美國FALCON）；青、鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；PBS（北京索萊寶科技有限公司）；RPMI-1 640（美國GIBCO）；DMEM（美國GIBCO）；L15（美國GIBCO）；FBS（美國ExCell Biology FBS500）；MTT（美國Amresco）；DMSO（溶解受試藥品）（美國SIGMA D2650）；土豆（沃爾瑪）；葡萄糖（源葉生物）；瓊脂粉（源葉生物）；無水乙醇，分析純（上海泰坦）；次氯酸鈉（分析純，國藥集團）。

1.3 供試腫瘤菌株

人肝癌細胞HEPG2、人胃癌細胞HGC27、人結腸癌細胞HT-29、人宮頸癌細胞HELA（中國科學院上海細胞庫）。

2 方法

2.1 分離鑒定

2.1.1 傳統分離培養

表面消毒：將采集新鮮濟南、臨沂和泰安產的戟葉牛皮消的根、莖和葉用自來水沖洗干凈，轉移至超凈臺，進行“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”的3 步表面消毒處理。處理過后繼續用無菌水沖洗5 遍，滅菌濾紙將表面水分吸干。

組織塊培養：超凈臺中操作，用消毒的剪刀和鑷子分別將根、莖與葉剪切成小的組織塊（0.5 cm×0.5 cm），分別從3 個部位中各隨機挑取20 個組織塊，每組設置4～5 個組織塊，分組好的組織塊置于含有青霉素（50 mg/L）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）的平板中，于溫度25 ℃，濕度80%的恒溫恒濕培養箱中進行內生真菌菌絲的生長情況的定期觀察。挑取尖端菌絲轉移到新的PDA 培養基中培養，至菌絲形態單一，即得到純化的菌株[15-16]。根據內生真菌菌株的培養的形態特征初步劃分為不同的形態型，拍照留存。根據菌株群落的培養特征，劃分為不同的形態型，繼續將分離純化后的菌株接種至PDA 固體試管斜面培養基上進行培養，4 ℃冰箱保存。

2.1.2 內生菌鑒定

觀察培養的內生真菌菌落形態，對照《真菌鑒定手冊》進行形態學特征鑒定。將“2.1.1”項下形態一致的泰山白首烏內生真菌菌株進行合并[16]，參考E.Z.N.A.真菌DNA 提取試劑盒說明書提取菌株DNA。以提取的DNA 為模板，采用真菌ITS 通用引物TIS4（5’-TCC TCC GCT TTA TTG ATA TGC-3’）和ITS5（5’-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG-3’）對菌株的r DNA-ITS 區域進行PCR 擴增。PCR 反應體系：2×Trans Taq Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 15 μl，Primer（10 μmol/L）各1 μl，Genomic DNA 10 ng；補充雙蒸水至 30 μl。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環，72 ℃延伸10 min。5 μl PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將合格的PCR 擴增產物送上海生工生物有限公司進行測序。內生真菌菌株測序得到的ITS 序列去除載體序列，利用NCBI 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST 進行比對，根據所得分子鑒定結果并結合形態學特征確定菌株。

2.2 代謝產物抗腫瘤活性

2.2.1 代謝產物的提取

按“2.1”項下方法分離得到的90 個形態型泰山白首烏內生真菌菌株為供試菌株，PDA 固體培養基中接種活化。待菌絲覆蓋培養基表面時，用直徑5 mm 打孔器制備10 個菌餅，放入裝有100 ml的PDA 培養基的錐形瓶中，每個菌種接種6 瓶。接種后于25 °C、180 r/min 振蕩培養7 d。發酵完成后，抽濾并收集發酵培養液，1∶1 乙酸乙酯萃取3 次，合并有機相，減壓濃縮，即得乙酸乙酯提取物[17]。干燥后于4 °C 冰箱中避光保存。

2.2.2 抗腫瘤活性測試

二甲基亞砜(DMSO)溶解乙酸乙酯粗提物后，用PBS 分別稀釋至0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/ml。采用MTT 法測定樣品抗腫瘤活性[17]。以人肝癌細胞HEPG2，人胃癌細胞HGC27，人結腸癌細胞HT-29，人宮頸癌細胞HELA 為受試對象，陽性對照采用阿霉素。將細胞放置于含10%FBS、青霉素和鏈霉素各100 U/ml 的DMEM 細胞培養液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養，48 h 換液傳代。消化傳代后顯微鏡下觀察細胞的生長情況。取對數生長期的細胞，胰酶消化后，10%小牛血清的完全培養液洗滌、懸浮，將100 μl 懸浮細胞液（2～4×104個/ml）接種于96 孔板中，培養24 h。吸棄培養液，每孔加入100 μl 含有不同藥物的完全培養基(含10%小牛血清，1%雙抗)，每種濃度設3 個平行孔，設空白對照組，培養72 h 后，每個孔加入5 mg/ml 的 MTT 10 μl，培養4 h，吸棄培養液后加入100 μl DMSO，振蕩至結晶完全溶解，用酶聯免疫監測儀在波長為570 nm 處測定A值，計算各濃度下的細胞抑制率，計算方法如下：

陰性對照孔相對A值=陰性對照孔絕對A值—空白對照孔絕對A值

藥敏孔相對A值=藥敏孔絕對A值—空白對照孔絕對A值

本研究采用SPSS 17.0 通過機率單位加權回歸法（Bliss 法）計算IC50。

3 結果與分析

3.1 內生真菌的分離鑒定及種群組成

將分離到的869 株內生真菌，根據培養特征劃分為90 個形態型，對不同形態型菌株ITS 基因與GenBank 中的參考序列進行分子系統學分析，結果見表1，有結果可知，鑒定得到的內生真菌屬于3 門、12 綱、14 目、14 科、18 屬和30 種。

表1 根據BLAST 序列分離得到的泰山白首烏內生真菌

(續表1)

3.1.1 組織類型對內生真菌種群結構的影響

組織因素在影響內生真菌的多樣性和分布規律發揮著重要的作用[18]，在屬的水平上，其對泰山白首烏內生真菌的組成影響也較為顯著，如圖1 所示。泰山白首烏根部內生真菌主要分布于8 個屬，其中，優勢菌屬為鐮刀菌屬Fusarium，占根中內生真菌的64.29%；泰山白首烏莖部內生真菌分布于9 個屬，優勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria，占莖中內生真菌的60%；泰山白首烏葉部內生真菌分布13 個屬，優勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria，占葉中內生真菌的56.25%；泰山白首烏內生真菌的葉豐度大于莖和根。3 個不同的組織部位中，鏈格孢屬Alternaria和炭疽菌屬Colletotrichum為三者共有屬，其他具有差異。結果表明，在不同組織部位中，泰山白首烏的內生真菌的分布差異顯著。

圖1 泰山白首烏不同部位中內生真菌組成及占百分比（%，屬）

3.1.2 產地對泰山白首烏內生真菌種群結構的影響

地理位置會影響內生真菌的多樣性[19]。在90 個形態型內生真菌菌株中，產地濟南的泰山白首烏分離39 個菌株，產地泰安分離得到26 個菌株，產地臨沂分離得到25 個。如圖2 結果所示，3 個產地的泰山白首烏優勢菌屬為鏈格孢屬Alternaria和鐮刀菌屬Fusarium，產地濟南的泰山白首烏內生真菌主要分布在12 個屬，優勢菌屬鏈格孢屬占38.46%，鐮刀菌屬占28.21%；產地泰安的泰山白首烏內生真菌主要分布在5 個屬，優勢菌屬鏈格孢屬占61.54%，鐮刀菌屬占26.92%；產地臨沂的泰山白首烏內生真菌主要分布在11 個屬，優勢菌屬鏈格孢屬占48.00%，鐮刀菌屬占32.00%。由此可知，產地對泰山白首烏內生真菌的群落組成和優勢菌群均有影響，群落組成影響較大。

圖2 不同產地泰山白首烏內生真菌組成及所占百分比（%）

3.2 泰山白首烏內生真菌的抗腫瘤活性

MTT 結果表明，有13 株內生真菌菌株代謝產物對HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 腫瘤細胞株表現抗腫瘤活性，占總數的14.4%。如表2 所示，B.sorokinianaJTY6、A. alternateJTY10、A. brassicicolaJTJ11、B. ochroleucaJTJ18、Xylariaceaesp. LTJ1、A. tenuissimaLTJ2、C. acutatumLTJ3 和A. alternataLTJ6 抗腫瘤活性較明顯。鏈格孢屬Alternaria是泰山白首烏內生真菌中篩選出抗腫瘤活性菌株的優勢菌屬，其中，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 的抗腫瘤活性尤其顯著，能夠顯著抑制HEPG2、HGC27、HT-29 和HeLa 腫瘤細胞株。A.tenuissimaLTJ2 對HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 4 種腫瘤細胞株的 IC50值分別為（2.21±0.61）、（3.11±0.46）、（8.25±1.11）、（3.85±0.60） μg /ml；A.alternataLTJ6 為（1.58±0.38）、（1.46±0.39）、（3.63±1.23）、（6.24±0.49） μg /ml。以上結果表明，A.tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 是泰山白首烏具有顯著抗腫瘤活性的內生真菌株，可以進一步研究其產生抗腫瘤活性的單體成分。

表2 泰山白首烏內生菌菌株的抗腫瘤活性

4 討論

泰山白首烏與“泰山黃精”、“泰山紫草”和“泰山四葉參”并稱為泰山四大名藥[2]，但因其自然繁殖率低等因素，導致資源匱乏，市場上供不應求。植物內生真菌與宿主長期協同進化，可以產生相同或相似的活性代謝產物[9]，通過對泰山白首烏內生真菌的深入研究將有效的緩解其資源匱乏，而內生真菌有可能成為開發泰山白首烏的新資源。

本研究表明泰山白首烏中內生真菌資源豐富，具有較豐富的多樣性，泰山白首烏內生真菌的分布在不同組織部位差異顯著，以豐度比較葉大于莖和根，具有明顯的組織特異性，產地對泰山白首烏的優勢菌群和群落組成有影響。除優勢屬、種外，分離得到的大豆疫霉、炭角菌和淡色赤殼菌等內生真菌菌株，也具有良好生物活性[20-22]。

植物內生真菌能產生與宿主相同或相似的活性成分及生物活性，本研究首次報道了篩選得到的13 株泰山白首烏內生真菌具有抗腫瘤活性，占總數的14.4%，其中，從葉中篩選到4 株抗腫瘤活性菌株，莖中篩選得到9 株抗腫瘤活性菌株，根中無，同時，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 兩種抗腫瘤活性尤其顯著，值得深入研究。然而，泰山白首烏的藥用部位為塊根，由于內生真菌在植物組織中的定殖不同，導致在不同組織部位的分布存在差異，具體原因還需要進一步深入研究。另外，從產地上來看，不同產地所篩選得到的抗腫瘤活性菌株數量及品種不同，濟南產泰山白首烏篩選到5 株抗腫瘤活性菌株，臨沂產泰山白首烏篩選到6 株活性菌株，泰安產泰山白首烏篩選到2 株活性菌株，綜上，泰山白首烏中內生真菌的種群結構的抗腫瘤活性是否存在與產地相關，需要進一步深入研究，而已經分離得到的活性菌株的次生代謝產物及其作用機制的研究也是下一個重要目標。