麻黃堿對PC12 細胞內BDNF、PSD95 和synapsin1 表達水平的影響

王 賢，牛 波，鄭芳昊 （. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第900 醫院, 福建 福州 50000；. 南方醫科大學藥學院,廣東 廣州 5055；. 佛山市中醫院, 廣東 佛山 58000）

麻黃堿是中藥麻黃的主要有效成分，但它也可以引起中樞神經系統毒副作用。麻黃堿屬于小分子生物堿，能夠通過血腦屏障對神經細胞產生直接毒性作用[1-4]。然而，有關麻黃堿神經毒性的作用機制并不完全清楚。腦源性神經營養因子(BDNF)已被證實參與學習、記憶等多種中樞神經系統的活動[5]。突觸后致密蛋白是突觸后膜胞質面聚集的一層均勻而致密的蛋白，其中PSD95 是主要成分之一[6]。而synapsin1 是維持突觸前膜功能的重要成分之一[7]。BNDF、PSD95 和synapsin1 與神經元結構完整性和功能的完備性密切相關。本研究以PC12 細胞為研究對象，考察麻黃堿的細胞毒性，同時檢測BDNF、PSD95 和synapsin1 表達水平的變化，初步探討麻黃堿引起細胞毒性的可能機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹽酸麻黃堿（批號：D03150702，赤峰艾克制藥科技有限公司）；BDNF 抗體（批號：ab108319）、PSD95 抗體（批號：ab18258）、synapsin1 抗體（批號：ab64581）均購自英國Abcam 公司。

1.2 細胞

PC12 細胞購自中科院細胞庫。

1.3 儀器

電子天平（德國Sartorious 公司）；孵育箱（Thermo公司）；酶標儀（BioTek 公司）；Western blot 設備（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細胞活性

將培養瓶里的PC12 細胞接種到96 孔板上，每孔接種6 000 個細胞，用含1%FBS（胎牛血清）的RPMI 1640 培養12 h 后，吸棄原培養基，加入RPMI 1640 基礎培養基，1 h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，使其終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、20 mmol，繼續培養24 h 后，加入終濃度為0.5 mg/ml 的MTT，繼續孵育4 h，吸棄培養液，每孔加入150 μl 的DMSO（二甲基亞砜），輕微震蕩10 min，在酶標儀檢測570 nm 處的光密度(OD)值。

2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態變化

將培養瓶的PC12 細胞接種到12 孔板中，用含1%FBS 的RPMI 1640 培養12 h 后，吸棄原培養基，加入RPMI 1640 基礎培養基1 h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，使其終濃度分別為10、500、1 000 μmol，繼續培養24 h 后，在倒置顯微鏡下明場視野觀察細胞形態變化。

2.3 Western blot 法檢測蛋白表達量變化

將6 孔板每孔接種105個PC12 細胞，用含1%FBS 的RPMI1640 培養12 h，換上基礎培養基RPMI1640，1h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，其終濃度分別為1、10、100、500、1 000 μmol，繼續培養24 h 后，迅速將培養基吸棄，置于-30℃冷凍數小時，然后在冰上每孔加相應量的RIPA（含1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑）裂解液，4℃震蕩30 min，將細胞裂解液收集到相應離心管里，4℃低溫高速(12 000 r/min)離心10 min。取出上清，蛋白濃度檢測(BCA)試劑盒測定蛋白濃度后，加入相應量的5×的上樣緩沖液和適量的RIPA 裂解液，95℃加熱10 min 制樣。制膠上樣，樣品80 V電泳結束后，400 mA 電流90 min 轉移至PVDF（聚偏氟乙烯膜）后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，按分子量切出相應條帶，分別孵育相應一抗過夜，洗滌后室溫孵育相應二抗2 h，漂洗后，增強化學發光(ECL)法顯影。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 麻黃堿對高分化PC12 細胞毒性試驗

MTT 結果如圖1 所示，麻黃堿在一定范圍內對PC12 細胞有一定的毒性，經擬合計算在PC12細胞中麻黃堿的IC25值為0.536 mmol，IC50值為2.8 mmol。

圖1 麻黃堿細胞活性試驗（MTT 法）

3.2 細胞形態變化

PC12 細胞形態學變化如圖2 所示，在20 倍鏡下觀察，隨著麻黃堿濃度的升高細胞數量與空白對照組相比逐漸減少，細胞突觸數量也隨之減少。1 000 μmol 濃度處理條件下，軸突長度顯著減短，細胞體邊緣模糊，細胞體積顯著變小。

圖2 麻黃堿對PC12 細胞形態變化的影響

3.3 麻黃堿對PC12 細胞BDNF 表達的影響

圖3 結果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細胞中BDNF 的蛋白表達量增加。當麻黃堿濃度為500 μmol 時，BDNF 的表達量約為空白對照組的1.58 倍，有統計學差異(P＜0.05)；而當麻黃堿濃度高達 1 000 μmol 時，BNDF 為對照組的1.91 倍(P＜0.001)。說明該濃度范圍內麻黃堿可以濃度依賴性的引起PC12 細胞中BDNF 表達升高。

圖3 麻黃堿對BDNF 表達水平變化的影響

3.4 麻黃堿對PC12 細胞PSD95 表達的影響

圖4 結果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細胞中PSD95 的表達增加。麻黃堿濃度為500 μmol時，PSD95 的蛋白表達水平約為空白對照組的1.38 倍，有統計學差異(P＜0.05)；而當麻黃堿濃度達到1 000 μmol 時，PSD95 表達量約上升為對照組的1.52 倍(P＜0.001)。說明該濃度范圍內麻黃堿可以濃度依賴性的引起PC12 細胞中PSD95 表達升高。

圖4 麻黃堿對PSD95 表達水平變化的影響

3.5 麻黃堿對PC12 細胞Synapsin1 表達的影響

圖5 結果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細胞中synapsin1 的表達量有下降的趨勢。其中，麻黃堿濃度為500 μmol 時，synapsin1 的蛋白表達水平約為空白對照組的0.65，具有統計學差異(P＜0.05)；而當麻黃堿濃度達到1 000 μmol 時，synapsin1 表達量下降至對照組的0.53(P＜0.001)。說明麻黃堿在該濃度范圍內可以引起PC12 細胞中synapsin1 表達降低。

圖5 麻黃堿對synapsin1 表達水平變化的影響

4 討論

麻黃歷來被中醫冠以“解表第一要藥”，是治療外感風寒表實證的重要中藥，主要用于風寒感冒，胸悶喘咳，風水浮腫等，麻黃湯就是以麻黃為君藥的治療表寒實證的代表名方。然而前期研究發現，給予大鼠連續灌胃麻黃，可以造成大鼠不同腦區損傷，其中對額葉皮層影響較大，HE 染色結果甚至觀察到神經元凋亡早期的形態學改變[8-9]。已經證實麻黃中對中樞神經系統有興奮毒性作用的主要成分是麻黃堿。麻黃堿的神經毒性可能與升高興奮性谷氨酸水平有關，過量的興奮性谷氨酸能引起多巴胺神經末梢的破壞和額葉皮層、丘腦、邊緣系統的神經變性。為了明確麻黃引起中樞神經系統毒性的機制，本研究中將麻黃堿單體作為研究對象，考察其在體外細胞模型中的毒性作用。

PC12 細胞源于鼠嗜鉻細胞瘤，在結構上和功能上與神經元有高度相似的地方，因其可重復性好，被廣泛應用于中樞神經系統的研究。本研究首先考察了不同濃度麻黃堿對PC12 細胞存活率的影響，確定了麻黃堿引起細胞毒性的濃度范圍。在此基礎上，分別考察不影響細胞存活率情況下（IC25值以下濃度）及顯著影響細胞存活率情況下（IC25值以上濃度），麻黃堿對中樞神經系統中相關功能蛋白的影響。

BDNF 是神經營養因子家族的肽生長因子的一員。在體實驗發現，BDNF 在大腦海馬的CA1區可通過促進興奮性突觸的發育來增強突觸強度。同時，BDNF 可以在皮層神經元中增加介導中樞神經中快速興奮性突觸傳遞的AMPA 受體的表達，提高動物興奮性[10-13]。而外源性的BDNF 則可以通過增強突觸間的傳遞，增強海馬神經元的興奮性[14]。以上研究表明，BDNF 與神經細胞的興奮性密切相關。PSD95 定位于突觸后膜，是高電子密度的半圓形區域形成的突觸后致密區的主要組成部分之一。研究發現在海馬神經元中過表達PSD95可以促進成熟谷氨酸能突觸以及谷氨酸受體的活性[6,15]。PSD95 鏈接了興奮性受體NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受體）和下游信號分子，并且在神經元成熟以及突觸的形成中發揮著重要作用[16]。盡管在多數神經退行性病變中，提高BDNF 和PSD95的表達水平可以顯著改善行為學，但是也有研究表明在生理狀態下，神經元的過度激活會引起神經元的功能的減退甚至導致神經損傷。由于BDNF 和PSD95 與神經元興奮性關系密切，在前期的行為學實驗中，表明麻黃堿灌胃給藥會引起大鼠自主活動的增加，并激活神經元，故我們在考察麻黃堿產生細胞毒性的機制時，檢測了BDNF 和PSD95 的蛋白表達水平。結果顯示，隨著麻黃堿濃度的增加，BDNF 和PSD95 的表達水平濃度依賴性地升高，當濃度達到500 μmol 時差異具統計學意義（P＜0.05），說明麻黃堿可以引起體外神經細胞模型的興奮狀態。

與此同時，通過觀察細胞形態變化，發現一定劑量的麻黃堿會引起PC12 細胞突觸數量下降和長度減短，說明麻黃堿會引起突觸丟失。文獻研究表明，synapsin1 是突觸的重要標志物，可以反應突觸形態上的完整性和功能[7]。由此，我們在考察麻黃堿對PC12 細胞形態影響的同時，采用Western blot檢測了synapsin1 的表達水平。梯度濃度麻黃堿處理PC12 細胞后synapsin1 的表達變化結果表明隨著麻黃堿處理濃度的增加，synapsin1 的表達水平降低，當濃度達到500 μmol 時差異具統計學意義（P＜0.05），說明麻黃堿有一定的細胞毒性的同時，也可以引起神經細胞的突觸毒性，突觸蛋白的丟失可能也是引起神經細胞毒性的原因之一。

綜上所述，本實驗結果表明麻黃堿可以對PC12 細胞產生毒性。與正常細胞相比，麻黃堿處理組的細胞在形態學上發生了明顯的變化，BDNF和PSD95 等與興奮性相關的蛋白表達出現了明顯升高，而與突觸功能有關的蛋白synapsin1 表達出現了明顯下降，說明麻黃堿產生中樞神經系統毒副作用的機制與BDNF、PSD95 及synapsin1 的表達變化有關。