啤酒花經抗氧化途徑減輕Aβ 損傷成骨細胞作用研究

夏天爽，劉曉燕，蔣益萍，李曉瑾，王果平，辛海量 （. 海軍軍醫大學藥學系生藥學教研室，上海 00433；. 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 83000）

骨質疏松癥（OP）是一種由骨吸收和骨形成之間的關系失衡造成，以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，導致骨質脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝疾病。其中，成骨細胞是骨形成的功能細胞，在維持骨穩態中起到關鍵作用[1]。目前，高氧化應激相關的骨丟失已成為骨質疏松研究領域的熱點。有研究表明，細胞保護酶是機體對抗氧化應激狀態下活性氧（ROS）損傷的主要機制，其活性主要由轉錄因子Nrf2 和FoxO 調控，而二者所介導的氧化應激通路同樣被證實具有調節成骨細胞氧化還原平衡以及促進骨形成分化的功能[2]。與此同時，β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉積可使機體ROS 生成增多，進而抑制成骨細胞的增殖、成骨基質的產生及礦化[3]。由此可見，Aβ 沉積偶聯的氧化損傷是破壞成骨細胞骨形成，進而引發骨丟失的一大誘因。

啤酒花（Hops,Humulus lupulusL.）為桑科葎草屬多年生草質蔓生藤本植物，其雌性球穗花序不僅作為啤酒釀造的添加原料，也是全球廣泛應用的植物藥，在歐洲廣泛用于緩解更年期潮熱及絕經后骨質疏松癥[4]。我們前期研究發現啤酒花能夠促進成骨細胞骨礦化結節的形成，降低活性氧水平，并顯著改善APP/PS1 轉基因小鼠的骨丟失[5-6]，但其對外源性Aβ 損傷成骨細胞的氧化應激水平及骨形成的影響尚不明確。此外，我們首次確認了氧化應激和Aβ 沉積之間的雙向關聯，及其在老年性骨質疏松癥發病中的重要作用[7-8]。故本文擬以Aβ 損傷的成骨細胞為模型，以Nrf2和FoxO1 兩條經典氧化應激相關通路為核心，對啤酒花的抗氧化能力及對骨形成干預作用進行探究。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

啤酒花藥材購于昌吉市山水啤酒花有限公司（產地：新疆昌吉；批號：PJH-01），經海軍軍醫大學藥學系生藥學教研室辛海量副教授鑒定為啤酒花Humulus lupulusL.的雌性球穗花序。稱取啤酒花藥材粉末70 g，加入料液比為1∶15 的75%乙醇，回流提取3 次，減壓濃縮干燥成浸膏，HPLC 測定得浸膏中主要成分黃腐酚含量為0.55%[9]，使用前配制成相應濃度（生藥量/ml）的提取液。

其他試劑及廠家：Aβ1-42寡聚體（上海吉爾）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，上海碧云天）；胎牛血清（Gibco，美國）；α-MEM 培養基等細胞培養試劑（天津灝洋）；堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（南京建成）；I 型膠原酶（COL-I）、骨橋蛋白（OPN）、核因子-E2-相關因子（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H：醌氧化還原酶（NQO1）、細胞叉頭框蛋白O1（FoxO1）、超氧化物歧化酶（SOD-2）抗體（Abcam，英國）。

1.2 實驗動物及原代成骨細胞分離培養

新生24 h Wistar 大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[合格證號：2013001831722；許可證號：SYXK（滬）2017-0004]。所有動物實驗均符合實驗動物倫理學要求。采用二次消化法從新生大鼠顱蓋骨分離得到原代成骨細胞，用含10%胎牛血清的α-MEM 培養液進行培養，取3～4 代成骨細胞進行后續實驗分析。

1.3 成骨細胞增殖及堿性磷酸酶檢測

取3～4 代成骨細胞計算其數目，配制成細胞濃度為1×104個/ml 細胞懸液接種于96 孔板，根據前期實驗結果[9]設置分組：空白對照組，模型組（40 μmol/L Aβ），陽性對照組（NAC, 2.5 mmol/L），啤酒花提取物低劑量組（HLE, 4 μg/ml）、中劑量組（HLE, 20 μg/ml）、高劑量組（HLE, 100 μg/ml），每組設置4 個復孔。24 h 后按照上述分組更換為含藥培養液。給藥48 h 后采用MTT 法檢測成骨細胞的增殖情況。

取3～4 代成骨細胞計算其數目，配制成細胞濃度為5×104個/ml 細胞懸液接種于24 孔板。24 h后分別更換為含藥培養液（給藥濃度同上）。培養過程中每3 d 更換1 次含藥培養液。第8 天裂解細胞，收集細胞裂解液，于4 ℃、13 800×g離心5 min。用對硝基苯磷酸二鈉法測定細胞ALP 活性[10]。參照ALP 染色試劑盒說明書對成骨細胞進行染色。

1.4 成骨細胞凋亡檢測

取3～4 代成骨細胞計算其數目，配制成細胞濃度為2×105個/ml 細胞懸液接種于6 孔板。24 h后分別更換為含藥培養液（給藥濃度同上）。給藥48 h后收集各孔中培養基上清液，加入200 μl 0.25%胰蛋白酶消化30 s，離心并重懸，參照凋亡檢測試劑盒裝載探針，室溫避光孵育5 min 后，用流式細胞儀進行凋亡率檢測。

1.5 蛋白質印跡檢測

取3～4 代成骨細胞接種于6 孔板，24 h 后分別更換為含藥培養液（給藥濃度同上）。給藥48 h后進行細胞裂解，提取細胞總蛋白，根據BCA 試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜、封閉后，分別加入COL-I、OPN、Nrf2、HO-1、NQO1、FoxO1 及SOD-2 抗體，4 ℃孵育過夜。用洗膜緩沖液（Trisbuffered saline/Tween-20，TBST）洗膜3×10 min，加入二抗，室溫孵育30 min。用TBST 再次洗膜3×10 min，采用ECL 試劑進行檢測。采用Tanon Image軟件對蛋白印跡進行半定量分析。

1.6 免疫熒光檢測

取3～4 代成骨細胞配制成濃度為2×104個/ml細胞懸液接種于無菌激光共聚焦皿中。24 h 后分別更換為含藥培養液（Aβ, 40 μmol/L HLE, 100 μg/ml）。給藥48 h 后用4%的多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 浸洗后用0.5% Triton X-100（PBS 配制）通透20 min，并用5% BSA 封閉液室溫封閉1 h。先后加入FoxO1 抗體及熒光二抗（TRITC 標記山羊抗兔抗體）進行孵育，加入DAPI 染液避光孵育10 min進行染核。最后洗去多余的DAPI 染液，加入少量PBS 使細胞保持濕潤，并置于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 啤酒花提取物促進Aβ 損傷成骨細胞增殖，提高ALP 活性

如圖1A 所示，與空白組相比，Aβ 損傷成骨細胞后，其增殖能力顯著降低。藥物治療后，低、中、高劑量的啤酒花提取物均可顯著促進Aβ 損傷成骨細胞的增殖。另一方面，與空白組比，Aβ 顯著降低了成骨細胞的ALP 活性，而啤酒花提取物顯著逆轉了Aβ 損傷成骨細胞的ALP 活性，促進成骨細胞的分化（圖1B-C）。

圖1 啤酒花提取物對Aβ 損傷成骨細胞增殖（A）及ALP 活性（B-C）的影響（n=4）

2.2 啤酒花提取物抑制Aβ 損傷成骨細胞凋亡

如圖2 所示，與空白組相比，Aβ 損傷提高了成骨細胞的凋亡率，而啤酒花提取物（20，100 μg/ml）可顯著抑制Aβ 損傷成骨細胞的凋亡。提示啤酒花提取物對Aβ 誘導的成骨細胞具有較強的抗凋亡作用。

圖2 啤酒花提取物對Aβ 損傷成骨細胞凋亡的影響（n=3）

2.3 啤酒花提取物促進Aβ 損傷成骨細胞中骨形成相關蛋白表達

如圖3 所示，Aβ 損傷成骨細胞后，細胞中骨形成相關蛋白COL-I 和OPN 的表達顯著降低。給予啤酒花提取物（20，100 μg/ml）干預后，COL-I 及OPN 的表達顯著增加，提示啤酒花可顯著促進Aβ 損傷成骨細胞的骨形成。

圖3 啤酒花提取物對Aβ 損傷成骨細胞中COL-I 及OPN 表達的影響（n=3）

2.4 啤酒花提取物調節Nrf2 氧化應激通路

采用Western blot 分析Aβ 和啤酒花提取物對成骨細胞中Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 和NQO1的影響。結果顯示，Aβ 顯著抑制了成骨細胞中Nrf2 及其下游蛋白HO-1 和NQO1 的表達；而低、中、高劑量的啤酒花提取物均可顯著促進Aβ 損傷成骨細胞中Nrf2、HO-1 及NQO1 的表達（圖4），提示其能夠通過介導Nrf2 信號通路發揮抗氧化作用。

圖4 啤酒花提取物對Aβ 損傷成骨細胞中Nrf2、HO-1 及NQO1 表達的影響（n=3）

2.5 啤酒花提取物調節FoxO1 抗氧化通路

采用免疫熒光及Western blot 分析Aβ 和啤酒花提取物對成骨細胞中FoxO1 信號通路的影響。結果顯示，與空白組相比，Aβ 顯著降低了成骨細胞中的FoxO1 含量，而啤酒花提取物（100 μg/ml）可顯著下調FoxO1 的表達，且使其更多聚集在細胞核內（圖5A）。此外，啤酒花提取物（4、20、100 μg/ml）還可顯著促進Aβ 損傷成骨細胞中FoxO1 及其下游蛋白SOD-2 的表達，提示啤酒花能夠通過介導FoxO1 信號通路發揮抗氧化作用。

圖5 啤酒花提取物對Aβ 損傷成骨細胞中FoxO1 及SOD-2 表達的影響（n=3）

3 討論

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，在骨形成過程中經歷增殖、分化、礦化和凋亡四個階段。其中，成骨細胞的增殖水平反映骨形成的強弱，其分泌的ALP 是成骨細胞分化階段的關鍵酶[11]，可介導骨組織礦化。在骨形成相關蛋白中，COL-I 是骨細胞外基質的主要成分之一，約占骨總蛋白的80%[12]，而OPN 是一種骨基質糖蛋白，能夠促進成骨細胞的黏附和分化[13]，二者均為成骨細胞分化成熟的標志。此外，Aβ 沉積會引起機體的氧化損傷，在骨代謝中可降低骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化，破壞成骨細胞的活性和功能，抑制骨形成[14]。我們前期研究同樣發現過量的Aβ 在聚集過程中會產生大量的活性氧，使機體處于高氧化應激狀態，反過來又刺激Aβ 產生和聚集，形成Aβ 與氧化損傷相偶聯[15]。該機制在老年性骨質疏松癥發病中處于特別重要的位置，并受到學界關注[16]。本研究中，啤酒花提取物可顯著逆轉Aβ 損傷所致的成骨細胞增殖水平下降、ALP 活性降低，以及COL-I 和OPN的低表達，表明其可顯著促進成骨細胞的成熟分化；并抑制Aβ 損傷成骨細胞的凋亡，表明其可顯著改善Aβ 沉積所致成骨細胞的活性損傷，促進骨形成，在維持骨穩態中發揮重要作用。

Nrf-2 信號通路是典型的抗氧化通路，能夠拮抗各種原因引起的氧化應激。激活Nrf2 信號通路不僅能夠抑制氧化損傷成骨細胞的凋亡，促進骨形成[17]，而且能夠拮抗Aβ 誘導的細胞損傷[18-19]。應激狀態下，Nrf-2 轉移入核內，與基因中的抗氧化反應元件結合，啟動下游Ⅱ相代謝酶基因的表達和轉錄，以增加細胞對氧化應激的抵抗作用，使細胞免于凋亡[20]。FoxO1 為調節成骨細胞氧化還原平衡和成骨功能的主要轉錄因子，其入核可激活下游SOD-2 抗氧化酶，調控細胞內的氧化還原平衡，并促進成骨細胞的增殖與分化，在骨代謝中同樣發揮著重要作用[20]。本研究結果表明，啤酒花可激活Aβ 損傷成骨細胞的Nrf-2 和FoxO1 信號通路，促進該氧化應激信號通路中相關蛋白的表達，增加成骨細胞對氧化應激的抵抗作用，使其免于凋亡，進而促進成骨細胞增殖與分化。提示啤酒花具有通過抗氧化而調控骨代謝、維持骨穩態之應用潛力。