馬齒莧提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用及其化學成分分析

施文彩，趙燕云，鄭 璇 （長海醫院臨床營養科, 上海 200433）

馬齒莧（Portulaca oleraceaL.）是一種藥食兩用植物，味酸、性寒，具有清熱解毒、涼血消腫之功效。現代藥理研究證實其有抗衰老、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化，以及保肝護肝等方面的藥理活性[1-2]。目前對馬齒莧保肝護肝的有效成分還不甚了解。本研究進一步明確馬齒莧提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有保護作用，并通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術分析馬齒莧提取物的主要成分，采用電噴霧電離源正離子模式和負離子模式對色譜流出物進行檢測，通過高分辨質譜分析結合相關文獻鑒定出蘋果酸、檸檬酸、亮氨酸、異亮氨酸、腺苷、琥珀酸、染料木素、酪氨酸、苯丙氨酸等15 種主要成分。

1 材料與方法

1.1 動物

80 只ICR 雄性小鼠，體重18～20 g。來源：海軍軍醫大學實驗動物中心購買于上海斯萊克實驗動物有限公司[生產許可SCXK（滬）2017-005，使用許可SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 藥物、試劑與儀器

馬齒莧干藥材（上海雷允上中藥飲片廠，產品批號：2 012 110 235）；CCl4溶液、乙醇、NaOH（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；橄欖油（益海嘉里食品營銷有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國默克公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；實驗用水（屈臣氏蒸餾水）；Agilent 1 290 Infinity型超高效液相色譜儀、Agilent 6 538 UHD、Accurate-Mass Q-TOF/MS（美國安捷倫公司）。

1.3 馬齒莧保肝抗炎作用有效成分篩選

1.3.1 馬齒莧提取物混懸液制備

馬齒莧藥材加15 倍80%乙醇，煎煮1 h。提取液濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，加水調節濃度為2 g/ml。以10% NaOH 溶液調節pH 至中性，記為A 液。5 000 r/min，離心10 min，上清液記為B 液，沉淀記為C 液。A、B 液分別減壓濃縮至半干狀態，與C 液分別轉移至60 ℃真空干燥，粉碎過120 目篩，即得馬齒莧全草、上清、沉淀提取物。用去離子水分別配制不同濃度的馬齒莧提取物混懸液，超聲過夜，4 ℃儲存，備用。

1.3.2 動物實驗

ICR 雄性小鼠80 只，根據體重隨機分為8 組，分別為對照組、CCl4急性化學性肝損傷模型組（模型組）、全草提取物低劑量(12.5 mg)組（全草低劑量組）、全草提取物高劑量(50 mg)組（全草高劑量組）、上清提取物低劑量(12.5 mg)組（上清低劑量組）、上清提取物高劑量(50 mg)組（上清高劑量組）、沉淀提取物低劑量(12.5 mg)組（沉淀低劑量組）和沉淀提取物高劑量(50 mg)組（沉淀高劑量組）。適應性喂養一周后，對照組和模型組小鼠分別經口灌胃0.5 ml 去離子水，3 種提取物的低劑量組和高劑量組小鼠分別以0.5 ml 對應濃度的馬齒莧提取物混懸液連續灌胃7 d，并監測體重。7 d 后，模型組、馬齒莧提取物干預組小鼠按照3 ml/(kg·BW)分別腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液，對照組小鼠注射等量橄欖油。實驗期禁食不禁水，16 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，將血液2 000 r/min 離心15 min 得血清，于長海醫院檢驗科檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST），ELISA 試劑盒檢測血清IL-6。

1.4 UPLC-Q-TOF/MS 檢測馬齒莧提取物有效成分

1.4.1 馬齒莧化學成分數據庫的建立

首先，檢索馬齒莧及其相關種屬藥材化學成分相關的文獻，根據文獻報道，收集馬齒莧中可能的化學成分信息；其次，通過Agilent 提供的“Formula-Database-Generator”軟件建立馬齒莧中已知化學成分的數據庫。

1.4.2 馬齒莧提取物溶液制備

取馬齒莧適量，加入5 ml 80%甲醇超聲15 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液供超高效液相色譜儀檢測用。

1.4.3 檢測條件

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters XSELECTTMHSS T3（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動相：0.1%甲酸（A）和0.1%甲酸乙腈（B）流動相體系。梯度洗脫程序如下：0～2 min，5%B；2～13 min，5%→95%B；13～15 min，95%B；分析時間15 min；流速為0.4 ml/min，進樣量為3 μl。

1.4.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子化（ESI）正、負離子模式；霧化氣壓力：50 psi；干燥氣流速：11 L/min；干燥氣溫度：350 °C；毛細管電壓：4000V（+）/3500V（-）；去簇電壓：120 V；Mass 掃描范圍：m/z50～1 000。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0 統計分析軟件處理，結果以均值 ± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單向方差分析檢驗，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett's T3 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 馬齒莧保肝抗炎作用有效成分篩選結果

2.1.1 體重

各組小鼠體重均呈上升趨勢，各組體重差異無統計學意義（見圖1），初步說明馬齒莧提取物對小鼠生長沒有明顯的毒副作用。

圖1 CCl4 急性肝損傷模型小鼠7 天的體重變化

2.1.2 肝功能指標

由圖2 可見，與對照組相比，CCl4急性化學性肝損傷模型組血清ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.001），說明造模成功。與模型組相比，全草高劑量組小鼠血清AST、ALT 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；沉淀高劑量組小鼠血清ALT 顯著降低（P＜0.05），AST 水平有降低趨勢但不具有統計學意義。

圖2 CCl4 急性肝損傷模型各組小鼠7 天的肝功情況

2.1.3 炎癥指標

由圖3 可見，與對照組相比，CCl4急性化學性肝損傷模型組血清IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，全草高劑量組小鼠血清IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），沉淀高劑量組小鼠血清IL-6 水平有降低趨勢但不具有統計學意義。

圖3 CCl4 急性肝損傷模型各組小鼠7 天血清中IL-6 水平

2.2 UPLC-Q-TOF/MS 檢測馬齒莧有效成分結果

2.2.1 質譜數據的采集

取馬齒莧樣品溶液，按照“1.4.3”項下進樣分析，全掃描總離子流圖如圖4 所示。

圖4 馬齒莧化學成分的UPLC-Q-TOF/MS 總離子流圖

2.2.2 化合物的信息檢索與驗證

將“Formula-Database-Generator”軟件建立的馬齒莧已知化學成分的數據庫導入“Masshunter Qualitative Analysis”軟件系統，依據數據庫對馬齒莧提取物總離子流質譜圖進行鑒定和確證，將檢索到的化學成分信息按照保留時間、質荷比、加合離子情況等進行分類整理。并將化合物按其質荷比在原質譜數據中進行反向提取，對提取到的質譜信息進行質量準確度的驗證并根據同位素峰比例等信息進行元素組成分析。推測出15 種化合物為馬齒莧80%乙醇提取物的主要成分，按照保留時間順序依次為：蘋果酸、檸檬酸、亮氨酸、異亮氨酸、腺苷、琥珀酸、染料木素、酪氨酸、苯丙氨酸、佛手苷內酯、金蓮花堿、6,7-二羥基香豆素、芳樟醇、金色酰胺醇/橙黃胡椒酰胺、金色酰胺醇酯/咸南藤酰胺乙酸酯（見表1），另外還有多糖、黃酮等化學成分。

表1 馬齒莧提取物UPLC-Q-TOF/MS 分析結果

3 討論

馬齒莧是一年生肉質草本植物，是常用的藥食兩用植物，已被列入“中國衛生部藥食兩用名單”，具有清熱解毒、涼血消腫等功效，特別是在保肝抗炎方面具有較好的功效[2]。

CCl4是經典的化學性肝損傷動物模型的肝毒物，可破壞肝細胞膜，從而使胞漿內可溶性酶如ALT、AST 等滲入血液中，并最終導致各種類型的肝細胞病變，甚至壞死[11]。正常肝內轉氨酶的含量約為血中的100 倍，1%的肝特異性細胞壞死即可使血清酶活性增加1 倍。因此，轉氨酶是肝細胞受損的敏感標志[12]。因而，血清中的ALT、AST 水平的高低可以敏感地反映肝臟細胞膜的受損程度。

本研究以CCl4誘導的急性肝損傷小鼠模型為研究對象，考察了馬齒莧乙醇提取物的保肝抗炎作用，結果顯示，高劑量馬齒莧全草提取物可以顯著降低CCl4導致的肝損傷和炎癥。馬齒莧沉淀提取物能夠顯著降低CCl4誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT 水平，對血清AST 和IL-6 水平有降低趨勢但不具有統計學意義。馬齒莧沉淀提取物對降低CCl4導致的肝損傷和炎癥有一定效果，但效果不及全草提取物，說明馬齒莧上清提取物可能也含有效成分，與沉淀提取物共同發揮保肝作用。因此，從本研究可以看出，馬齒莧沉淀及上清中均存在保肝抗炎的有效成分，且沉淀提取物可能起主要作用，但馬齒莧發揮保肝抗炎作用是沉淀與上清提取物中有效成分共同發揮的。中藥是世界四大傳統醫藥體系中理論最完整、醫療實踐最豐富、療效最確切的傳統醫藥體系[13]。因為中藥的復雜性，中藥的藥效機制研究一直是個難點。有學者歸因于中藥功效相關的多成分、多靶點、多環節之間組成的一個相互協同與制約的復雜網絡[14]。筆者認為，與馬齒莧全草提取物相比，沉淀提取物的抗炎保肝作用較差的原因可能是馬齒莧的抗炎保肝作用是通過多成分、多靶點、多環節的相互協同作用實現的，且需維持一定的藥物濃度才能顯著性的發揮抗炎保肝作用。

為了進一步分析馬齒莧抗炎保肝作用的有效成分，本研究通過UPLC-Q-TOF/MS 技術對該全草提取物進行分析和鑒定，初步發現約有15 種主要化學成分。已研究發現，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸為小分子有機酸，具有抗腫瘤、抑菌、抗血栓、抗病毒等作用[15]；亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸為營養增補劑；6,7-二羥基香豆素等化合物是自然界重要的天然有機化合物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種功效[16]。因而，馬齒莧提取物能夠發揮抗炎護肝作用可能是由以上主要化學成分共同作用的結果，具體的作用機制有待深入研究。