五味子乙素通過(guò)ROS 介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的研究

王瑋婷，殷雪琴，夏金娥，張夏炎 （海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院藥劑科 上海 200433）

在全球范圍內(nèi)，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因，2018 年約有210 萬(wàn)女性疑似患有乳腺癌，占女性癌癥的25%[1]。在我國(guó)，乳腺癌在女性腫瘤中發(fā)病率居首位，死亡率居第5 位，近幾十年來(lái)乳腺癌負(fù)擔(dān)迅速增長(zhǎng)[2]。目前，雌激素敏感的乳腺癌患者主要以內(nèi)分泌治療為主，然而，缺乏激素受體的乳腺癌細(xì)胞通常使用化療藥物，如紫杉醇和阿霉素[3]。但是，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均表現(xiàn)出毒性反應(yīng)，這限制了其臨床應(yīng)用。此外，細(xì)胞毒等抗腫瘤藥物表現(xiàn)出的細(xì)胞耐藥性進(jìn)一步限制其應(yīng)用。因此，迫切需要尋找毒性較小、效果較好的治療藥物。

五味子乙素（schisandrin B, Sch B）是從五味子中提取的主要活性成分[4]。據(jù)報(bào)道[5]，Sch B 可通過(guò)抑制NF-κB 激活及MAPK/ Erk/p38/c-Jnk 信號(hào)通路激活而有效減輕炎癥反應(yīng)，NASSER 等[6]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過(guò)抑制PI3K/AKT 和STA3/JAK2 信號(hào)通路磷酸化，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生發(fā)揮抗前列腺癌作用，Wang 等[7]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過(guò)TGF-b信號(hào)通路靶向miR-101-5p 抑制大鼠肝纖維化。Dai 等[8]發(fā)現(xiàn)，Sch B 可通過(guò)STAT3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗乳腺癌活性，但是Sch B 如何影響乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡能力及具體機(jī)制尚不清楚。本研究以Sch B 為研究對(duì)象，探討其對(duì)人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(中科院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)：SCSP-5043)；甘草查爾酮A(純度≥98%，批號(hào)76296-75-6，上海麥克林生化科技有限公司)；CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、JC-1 熒光探針、DCFH-DA 熒光探針、Hoechst 33342 染色劑、PBS（大連美侖生物）；1640 培養(yǎng)基、胎牛血清( FBS) （美國(guó)HyClone 公司）；ECL 發(fā)光液、BCA 蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo 公司)；Bcl-2、 Bax、 CHOP、 GPR78、 ATF4、 PERK、 p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、β-actin、二抗(美國(guó) Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/ml 鏈霉素及100 U/ml 青霉素的L-15 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞2～3 d 可傳代培養(yǎng)。Sch B藥物處理時(shí)，首先取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞分為對(duì)照組和藥物組，根據(jù)細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果計(jì)算IC50，藥物組分為Sch B 低劑量組劑量（1/2 倍IC50），Sch B 中劑量組（1 倍IC50），Sch B高劑量組（2 倍IC50）。

1.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率

取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期MDA-MB-231 細(xì)胞，以8×103/100 μl 細(xì)胞密度接種于96 孔板，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞分為空白組（含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）、對(duì)照組（含培養(yǎng)基，含細(xì)胞，不含藥物）和藥物處理組，藥物處理組分別以終濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的Sch B處理細(xì)胞24 h，每組3 個(gè)復(fù)孔。24 h 后每孔加入CCK-8 溶液(10 μl), 于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算藥物IC50值。

細(xì)胞存活率=[(OD藥物-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)]×100%

細(xì)胞克隆形成分析：取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期MDAMB-231 細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，輕輕搖動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，過(guò)夜貼壁。分為對(duì)照組和藥物組，對(duì)照組加等體積的培養(yǎng)基，藥物組分別加以終濃度為（10、20、40 μmol/L）Sch B 培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。然后用PBS清洗2 次，室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡觀察克隆形成情況，觀察3 個(gè)視野中克隆數(shù)量。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期MDA-MB-231 細(xì)胞，以每孔2.5×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度接種于6 孔板，置培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別將終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 處理24 h。用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，結(jié)合緩沖液（100 μl）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式管，然后再分別加入Annexin V-FITC（5 μl）和PI 染液（5 μl），室溫孵育15 min（避光），最后加入結(jié)合緩沖液（400 μl）混勻，流式儀上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)low Jo 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.5 DCFH-DA 探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧

將生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期MDA-MB-231 細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度接種于12 孔板，置培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別將終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 處理24 h。DCFH-DA 染液用PBS 1∶1 000 稀釋成工作液，每孔加入200 μl 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，倒置熒光顯微鏡拍照，Image J 軟件檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 Wester blot 法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

將生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期MDA-MB-231 細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/ml 細(xì)胞密度接種于6 孔板，于培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞依次分為對(duì)照組和藥物組，對(duì)照組細(xì)胞加等體積培養(yǎng)基，藥物組分別加終濃度為10、20、40 μmol/L 的Sch B 及加或者不加活性氧(ROS)清除劑（NAC）5 mmol/L, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA 2 mmol/L 處理24 h。用RIPA（含PMSF 蛋白酶抑制劑）裂解液提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液金屬浴（100 ℃）使蛋白變性。20 μg 蛋白樣品經(jīng)PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育一抗（4 ℃冰箱過(guò)夜），1×TBST 洗滌3 次，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞存活率的影響

圖1 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，隨著藥物濃度增大，細(xì)胞存活率下降，其IC50為19.16 μmol/L，故選擇1/2 倍IC50（10 μmol/L），1 倍IC50（20 μmol/L），2 倍IC50（40 μmol/L）3 個(gè)劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增大，細(xì)胞克隆形成顯著被抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞存活增殖的影響

2.2 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴，具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）使抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

DCF-DA 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）組綠色熒光逐漸增強(qiáng)，顯示細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增高，且呈劑量依賴，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，活性氧清除劑NAC（5 mmol/L）預(yù)處理2 h 可顯著抑制由Sch B 導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS 增多(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

2.4 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

異常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sch B（10、20、40 μmol/L）分別使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α 表達(dá)增多且呈劑量依賴，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA（2 mmol/L）預(yù)處理2 h，可顯著抑制由Sch B 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GPR78、p-eIF2α 表達(dá)降低(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 五味子乙素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

2.5 ROS 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響

上述結(jié)果表明Sch B 可以使細(xì)胞內(nèi)ROS 升高，Sch B 也可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證ROS 升高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的聯(lián)系，MDA-MB-231 用ROS 清除劑NAC（5 mmol/L）預(yù)處理2 h，結(jié)果顯示，NAC 可逆轉(zhuǎn)由Sch B 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α 顯著降低(P＜0.05)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明， 5 mmol/L NAC可逆轉(zhuǎn)由Sch B 引起的細(xì)胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)顯著升高，促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 ROS 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是臨床上特別常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年的發(fā)病率和死亡率都在增加，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，是不受控制的細(xì)胞增殖和抵抗凋亡的結(jié)果[9]。盡管癌癥研究領(lǐng)域取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但由于對(duì)化療耐藥和高復(fù)發(fā)率，乳腺癌的總體生存率仍然不令人滿意，因此，大量的研究都集中在發(fā)現(xiàn)新的有效的治療乳腺癌的候選藥物中[10]。從植物中提取的天然化合物具有更有效和更少的副作用被認(rèn)為是抗癌藥物的重要來(lái)源。

ROS 在細(xì)胞存活和死亡中起著關(guān)鍵作用。在正常生理?xiàng)l件下，適當(dāng)水平的ROS 有助于細(xì)胞存活。然而，過(guò)量的ROS 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡細(xì)胞死亡[11]。ROS 作為不良刺激之一，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，稱為ROS 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。在本研究中，MDA-MB-231 細(xì)胞在與Sch B 孵育前先經(jīng)ROS 清除劑NAC 預(yù)處理。凋亡減輕，ROS 生成減少，CHOP，GPR78 和p-eIF2a 表達(dá)下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕。這說(shuō)明Sch B 誘導(dǎo)的MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性凋亡中，ROS是不可或缺的。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中傳導(dǎo)和提供蛋白質(zhì)折疊環(huán)境的細(xì)胞器，因?yàn)樗鼘?duì)刺激的敏感性會(huì)導(dǎo)致某種情況發(fā)生成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡的各種細(xì)胞生物學(xué)生理和病理事件的一種高度保守的細(xì)胞防御機(jī)制，如抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[13]。GPR78 是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子，GPR78 的激活增加了真核啟動(dòng)子2 alpha (eIF2α) 51 位絲氨酸的磷酸化，從而抑制蛋白的合成，磷酸化的eIF2α 促進(jìn)活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和C/EBP 同源蛋白(CHOP) 的表達(dá)，CHOP是調(diào)節(jié)Bcl-2 家族蛋白表達(dá)的關(guān)鍵促凋亡轉(zhuǎn)錄因子[14]。我們發(fā)現(xiàn)，Sch B 可引起乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CHOP，GPR78 和 p-eIF2α 蛋白水平呈劑量依賴性增加，當(dāng)使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA 后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕。

綜述所述，Sch B 可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，使p-eIF2α 蛋白激活，GPR78 和CHOP 表達(dá)增多，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。本研究可為乳腺癌的輔助治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。