RP-HPLC定量分析茶葉中幾種主要兒茶素類有效成分*

劉少靜，譚 雄，王曉茹，張德柱，秦 蓓,

（1.西安醫學院 藥學院，陜西 西安710021；2.成都醫學院 藥學院，四川 成都610500；3.陜西盤龍藥業集團股份有限公司，陜西 西安710025；4.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安710065）

茶葉是傳統的藥食同源天然保健飲品，茶多酚是茶葉中酚類化合物及其衍生物總稱，包括兒茶素類、黃烷醇類、花青素類、黃酮類和酚酸類等[1,2]。茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、降血糖、降血脂、預防肝臟及冠狀動脈粥樣硬化等廣泛藥理作用。被廣泛應用于食品、功能性飲料、保健品及化妝品中[3,4]。兒茶素類化合物是茶多酚類物質的主要藥理活性成分，含量占比可達60%～80%。文獻調研表明，兒茶素可抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡；具有預防心腦血管疾病及保肝護肝、抗菌、抗病毒等藥理作用[5,6]。

其中，沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）5種化合物是茶葉質量控制的關鍵成分[7,8]，目前，較多文獻報道了紫外分光光度法及高效液相色譜法測定茶葉中茶多酚的含量[3,9]，但較少對茶多酚中各單體有效成分進行分析比較，因此，本研究建立了RP-HPLC定量分析5個品種茶葉中5種兒茶素類成分，為茶葉的質量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；FA1004B型電子天平（0.1mg，上海越平科技儀器有限公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品GC、EGC、EGCG、EC、ECG（中國藥品生物制品檢定所提供，純度≥98%）；5種茶葉均購自西安輕工茶葉批發市場，由西安醫學院藥學院秦蓓教授鑒定；甲醇（色譜純 美國fisher公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX ODS C18（5μm×4.6mm×250mm）；檢測波長：280nm；柱溫：30℃；流速：0.8mL·min-1；進樣量：5μL；流動相（甲醇∶2‰磷酸水溶液）：0～7min：28∶72，7～15min：20∶80，15～35min：28∶72。

1.2.2 溶液制備

（1）對照品溶液的制備 分別精密稱取GC（5mg）、EGC（5mg）、EGCG（2.6mg）、EC（2.9mg）、ECG（3.1mg）對照品適量，加流動相溶解并定容至容量瓶中，制得對照品母液。精密吸取一定量母液，采用流動相逐級稀釋配制成系列混合對照品溶液，其中GC、EGC濃度依次為：100、200、250、300、350、400μg·mL-1；EGCG濃度依次為：104、138.67、173.33、260、390、520μg·mL-1；EC濃度依次為：116、154.67、193.33、290、435、580μg·mL-1；ECG濃度依次為：124、165.33、206.67、310、465、620μg·mL-1。4℃冷藏備用。

（2）樣品溶液的制備 茶葉揉碎，稱取5個品種茶葉各約5.0g，置于錐形瓶中，分別按照1∶30的料液比加入60%乙醇水溶液，于80℃下超聲提取50min，抽濾，濾液定容至250mL容量瓶中，過0.22μm有機微孔濾膜后進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

由于兒茶素類化合物中酚羥基的存在，其具有一定酸性，為保證良好的色譜峰型及分離度，向流動相體系（甲醇-水）中加入H3PO4并進行梯度洗脫，在該色譜條件下，5個主成分色譜峰均獲得良好分離度。圖1為色譜圖。

圖1 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 線性關系

按照擬定色譜條件對系列混合對照品溶液進行HPLC檢測，以樣品濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。5種兒茶素類化合物的保留時間、回歸方程、相關系數和線性范圍見表1。

表1 5種成分的回歸方程、相關系數與線性范圍Tab.1 Regression equation,correlation coefficient and linear range of five components

由表1可見，5種化合物在一定濃度范圍內線性關系良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 將混合對照品溶液在擬定色譜條件下連續進樣5次（進樣量：5μL），記錄色譜峰面積，計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積的RSD，分別為0.26%、0.21%、0.36%、0.22%和0.37%，表明精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 稱取同一供試樣品（安吉白茶）5份，各約5.0g，按照“1.2.2”項下方法平行制備5份樣品溶液，于擬定色譜條件下進樣（進樣量：5μL），考察5個化合物峰面積變化，計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積RSD分別為2.43%、1.87%、3.78%、1.64%和3.47%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品（安吉白茶）溶液，在擬定色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24h進樣檢測，記錄色譜峰面積。結果GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積的RSD分別為1.26%、2.03%、3.58%、1.73%和3.63%。表明供試品溶液在24h內穩定。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取含量已知的同一批供試品（安吉白茶）粗粉5份，各約2.5g，置于錐形瓶中，分別加入5種兒茶素對照品適量，制備供試品溶液并進樣分析。計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG的平均回收率（n=5）分別為：98.83%（RSD=2.81%）、98.80%（RSD=2.46%）、97.83%（RSD=2.91%）、100.41%（RSD=1.64%）、99.38%（RSD=2.54%）。

2.4 樣品測定

在擬定色譜條件下，對5個供試品溶液進行HPLC分析檢測，記錄5個兒茶素類化合物的峰面積，帶入標準曲線方程，計算含量。結果見表2。

表2 5種綠茶中兒茶素類化合物含量測定結果（%，n=3）Tab.2 Result of content determination of 5 samples（%,n=3）

將各個樣品的HPLC譜圖與5種對照品譜圖進行對比分析，發現5個不同品種茶葉中均含有GC、EGC、EGCG、EC、ECG 5種化合物，由表2可見，不同品種茶葉中含量最高的均為EGCG、其次為EC、含量最低的為ECG。不同品種茶葉之間兒茶素類含量存在一定差異。

3 結論

兒茶素類化合物是茶葉中主要藥理活性成分，不同品種茶葉中兒茶素類成分含量存在差異。本文建立了高效液相色譜法測定5種茶葉樣品中5個兒茶素類化合物含量，該方法快速、準確、分離度高。這種質控標準的建立為茶葉品質的保證及茶多酚類產品的質量控制提供了依據。