超聲波輔助鈴蘭總強心苷提取工藝的優化*

黃泰奇，李成成，朱 銳，黃啟東，金衛華

（武漢東湖學院 生命科學與化學學院，湖北 武漢430212）

強心苷是由強心苷配基與糖類縮合成的苷類，常見于夾竹桃科、百合科的植物中。自上世紀30年代地高辛被成功分離起，已經有多種強心苷用于治療心力衰竭及某些心律失常，但由于強心苷有效劑量與中毒劑量接近，故其應用受到限制[1]。但近些年來發現強心苷具有抗腫瘤、鎮痛等作用[2，3]，強心苷類化合物的應用再次受到關注。

鈴蘭（Convallaria keiskei Miq.）為百合科鈴蘭屬植物,別名山谷百合。具有藥用、觀賞價值[4]。鈴蘭花含揮發油等芳香物質，可制作香料并應用于食品及日化工業。鈴蘭含有強心苷、皂苷等活性成分，其中，鈴蘭毒苷曾用于急性及慢性心力衰竭，近些年來還發現其有抗衰老的功能[5]。陳玉昆等人以鈴蘭毒苷為標準品，探究出苯-乙醇（9∶1）為提取溶劑的鈴蘭毒苷提取純化工藝，但溶劑中苯為第一類致癌物質，且工藝中溶劑消耗量大、萃取時間長，并只針對鈴蘭毒苷一種強心苷設計提取工藝，可能導致其他有效強心苷因此流失。因此，筆者結合超聲波提取，采用毒性較低的乙醇、乙酸乙酯、石油醚、水等溶劑，通過單因素實驗、多因素實驗探究最佳提取條件，確定80%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶10、超聲提取時間120min、提取溫度70℃為鈴蘭總強心苷最佳提取工藝。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

I3型紫外-可見分光光度計（海能儀器）；KQ-100DE超聲波清洗機（昆山市超聲波儀器有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；分析天平（梅特勒-托利多）。

地高辛標準品（東京化成工業株式會社）；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90℃）、苦味酸等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 材料

實驗所用材料為鈴蘭（Convallaria keiskei Miq.）的全草，產自遼寧撫順。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系 取地高辛標準品0.0100g，加60%乙醇溶解并定容至25mL制成標準液。量取標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，60%乙醇定容至1mL，每種濃度標準液加入Baljet試劑（1%苦味酸溶液與1mol·L-1NaOH溶液按照95∶5體積比混合）4mL，搖勻，室溫避光反應30min，在495nm波長下測吸光值[6，7]，得回歸方程y=3.1043x+0.0211，R=0.9994，說明地高辛標準品在0～0.24mg·mL-1的濃度下有良好線性關系。結果見圖1。

圖1 標準曲線圖Fig.1 Standard Curve

2.1.2 樣品溶液制備方法 鈴蘭全草粉碎，過100目篩，稱取2.0000g，20mL 60%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取30min，過濾，旋轉蒸發回收乙醇，殘液加10%Pb（Ac）2溶液2mL沉淀過濾去除色素，加飽和K2SO4溶液2mL沉淀多余的Pb（Ac）2，乙醇定容至25mL（乙醇終濃度為60%），取0.5mL加60%乙醇定容至1mL即為樣品溶液。

2.1.3 精密度實驗 取標準液0.45mL，60%乙醇定容至1mL，按2.1.1中方法重復6次測定吸光值，測定結果見表1。

由表1可見，吸光值的RSD為0.11%，說明儀器精密度良好。

表1 精密度實驗結果Tab.1 Result of precision experimental

2.1.4 穩定性實驗 量取2.1.2中樣品溶液1mL，按2.1.1中方法顯色，每隔5min測一次吸光值，測定測定結果見表2。

表2 穩定性實驗結果Tab.2 Result of stability experimental

由表2可知，吸光值RSD為1.78%，說明30～55min內吸光值較穩定。

2.1.5 重復性實驗 量取6份2.1.2中樣品溶液1mL，按2.1.1中方法測定吸光值，測定結果見表3。

表3 重復性實驗結果Tab.3 Result of repetitive experimental

由表3可知，吸光值RSD為0.95%，說明該法重復性良好。

2.1.6 加樣回收實驗 稱取一定量已知含量的鈴蘭全草樣品6份并加入一定量地高辛標準品，按2.1.2中方法制備樣品液，按2.1.1中方法測定吸光值，計算回收率，測定結果見表4。

由表4可知，平均回收率為98.48%，RSD為2.06%[8]。

表4 加樣回收實驗結果Tab.4 Result of recovery experimental

2.2 溶劑種類對總強心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末8份，分別加入乙醇20mL，濃度分別為20%、40%、60%、80%和無水乙醇，石油醚-乙酸乙酯（1∶9）、乙酸乙酯、水，30℃超聲提取3次，每次30min，過濾，旋轉蒸發回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結果見圖2。

圖2 溶劑種類對總強心苷提取率的影響Fig.2 Effect of solvents type on extraction rate

由圖2可知，說明80%乙醇為最佳提取溶劑，因此，選擇80%乙醇做進一步優化實驗。

2.3 料液比對總強心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末10份，分別加入4、5、6、7、8、9、10、11、12、13倍量80%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取時間為30min，過濾，旋轉蒸發回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結果見圖3。

由圖3可知，1∶11為最佳料液比，因此，選擇1∶11料液比做進一步優化實驗。

圖3 料液比對總強心苷提取率的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on extraction rate

2.4 時間對總強心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末6份，加入11倍量80%乙醇30℃超聲提取3次，每次超聲提取時間分別為30、60、90、120、150、180min，過濾，旋轉蒸發回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結果見圖4。

圖4 提取時間對總強心苷提取率的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate

由圖4可知，120min為最佳提取時間，因此，選擇120min做進一步優化實驗。

2.5 溫度對總強心苷提取率的影響

稱取2.0000g鈴蘭粉末6份，加入11倍量80%乙醇分別在30、40、50、60、70、80℃下超聲提取3次，每次超聲提取時間為120min，過濾，旋轉蒸發回收溶劑，按2.1.2中方法制備樣品液，取1mL樣品液按2.1.1中方法測定吸光值，測定結果見圖5。

由圖5可知，隨著溫度升高提取率也不斷增大，70℃提取率最高，但80℃迅速下降，可能是溫度過高導致部分強心苷水解。

圖5 提取溫度對總強心苷提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate

2.6 正交實驗

2.6.1 正交實驗因素水平表

根據上述單因素實驗設計L9（33）正交實驗以探究各因素對總強心苷提取率的影響，表5為各因素水平。

表5 正交實驗各因素水平表Tab.5 Level table of each factor in orthogonal experiment

2.6.2 正交實驗結果及分析

正交實驗設計和方差分析由SPSS 23軟件完成。結果中P＜0.05具有統計學意義。正交實驗結果見表6。

表6 正交實驗結果Tab.6 Result of orthogonal experiment

由表6可知，溫度是影響總強心苷提取率的主要因素，其次為時間及料液比，且計算優選水平組合與實驗中最優水平組合相吻合，即最佳因素水平組合為料液比1∶10時，70℃條件下提取120min。

表7為正交實驗方差分析結果。

表7 正交實驗方差分析結果Tab.7 Result of variance analysis in orthogonal experiment

由表7可知，溫度對提取率的影響達到了顯著水平，時間和料液比沒有達到顯著水平，故實際提取過程中應注意對溫度的控制。

3 結論

（1）單因素實驗所用溶劑中，以80%乙醇提取效果最好，40%、60%乙醇次之，最佳提取條件為料液比1∶11，70℃超聲波提取3次，每次120min，此條件下制得的樣品液吸光值為0.638，換算為鈴蘭藥材中總強心苷含量為0.25%，與文獻[9]中報道的0.2%含量基本相符。

（2）正交實驗結果表明，最佳提取條件為料液比1∶10時，70℃條件下提取120min，重復3次，而單因素實驗中料液比最佳條件是1∶11，但根據正交實驗結果可知，料液比這一因素對提取率的影響不顯著，因此，以正交實驗結果為準。

相比于陳玉昆等人使用苯-乙醇（9∶1）提取48h，本工藝通過超聲波輔助，將原48h的提取時間縮短為6h，顯著提高了萃取效率，且使用了低毒的80%乙醇代替了價格較高的含苯有毒溶劑，減少有毒溶劑對操作者的危害。但根據2.5中溫度對提取率影響實驗結果可知，溫度到達80℃時提取率迅速下降，原因可能是提取溶劑中含水，高溫導致強心苷內酯環水解，故實際提取溫度不宜過高。綜上所述，本工藝具有高效、環保、低成本等優點，適用于工業生產。