尿液中膀胱癌生物標志物的研究進展

董陶濤，陳林，劉迅，王凱，何江樞，陳書練，楊進，羅旭

(1.遵義醫(yī)科大學，貴州 遵義 563000； 2.成都大學附屬醫(yī)院泌尿外科，成都 610081)

近幾十年來，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率急劇上升[1]。80%的膀胱癌患者為非肌肉浸潤性膀胱癌，其余患者表現(xiàn)為肌肉浸潤性膀胱癌[2]。膀胱癌患者盡管接受了根治性治療，但仍有高達50%的非肌肉浸潤性膀胱癌患者最終復發(fā)，其中30%的患者進展為肌肉浸潤性膀胱癌[2]。由于膀胱癌復發(fā)率高，建議根據(jù)疾病的初始分級和分期間隔進行監(jiān)視膀胱鏡檢查。在病情嚴重的情況下，3個月內避免膀胱鏡的使用[3]。尿液細胞學是一種非侵入性的檢測和監(jiān)測尿路上皮性膀胱癌的方法。細胞學檢查的特異性較高，但敏感性低限制了其在常見低級別膀胱尿路上皮性癌中的應用[3]。

目前，美國食品藥品管理局批準了6種與膀胱鏡檢查相結合用于臨床尿液分析的方法：核基質蛋白(nuclear matrix protein，NMP)22酶聯(lián)免疫吸附試驗、NMP22 BladderChek和UroVysion已獲得批準進行膀胱癌的診斷和監(jiān)測；免疫細胞(UCyt+)、膀胱腫瘤抗原(bladder tumor antigen，BTA)-TRAK和BTA-STAT已被批準僅用于原發(fā)性腫瘤診斷后的膀胱監(jiān)測。在膀胱癌中，以尿液為基礎的診斷試驗為提高膀胱癌的檢出率提供了一種無創(chuàng)方法。非侵入性檢測膀胱癌的方法不僅對患者的損傷更小，而且成本更低[4]。此外，尿液生物標志物可能用非侵入性的方式評估潛在新治療靶點的效果[5-6]?，F(xiàn)就膀胱癌尿液生物標志物的研究進展進行綜述，進一步討論以尿液為重點的膀胱癌生物標志物與疾病復發(fā)和進展的關系。

1 蛋白質生物標志物

1.1NMP22 NMP22是一種從凋亡細胞中釋放出來的核有絲分裂蛋白，參與DNA重組和復制[7]。美國食品藥品管理局已批準使用NMP22進行膀胱癌的早期診斷，并評估膀胱癌復發(fā)的風險。一篇包含71項研究、22 260名參與者的Meta分析闡述了NMP22的靈敏度和特異度，結果顯示NMP22的靈敏度(68%，95%CI62%～74%)高于尿脫落細胞學(44%，95%CI38%～51%)，但特異度(79%，95%CI74%～84%)低于尿脫落細胞學(96%，95%CI94%～98%)[8]。為了提高特異性，臨床醫(yī)師必須明確可能導致假陽性的原因，加強NMP22檢測臨床應用的可行性。研究表明，尿液NMP22水平與腫瘤分期和分級密切相關[9]。NMP22仍是目前研究最充分的生物標志物之一。但有Meta分析認為，NMP22單獨使用時靈敏度較低[8]。NMP22檢測可以測量各種條件下可能進入尿液的細胞數(shù)，包括膀胱腫瘤的表面脫落。腫瘤惡性程度越高，敏感性越高，適用于高級別膀胱癌的早期診斷，可以減少膀胱鏡檢查次數(shù)，減少醫(yī)療費用，提高患者生活質量。

1.2BTA BTA是由膀胱癌細胞產(chǎn)生的人補體因子H相關蛋白，干擾補體激活并使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視[10]。美國和歐洲進行的多中心研究發(fā)現(xiàn)，BTA檢測在診斷膀胱癌方面明顯較尿液細胞學更敏感[11]。有研究表明，BTA診斷膀胱癌的總體靈敏度和特異度分別為57%～83%和60%～92%[12-13]。在良性膀胱疾病患者中，如腎結石、感染和血尿等，BTA檢測報告的特異性需嚴格評估，血尿中含有補體因子H，可與BTA相關抗體發(fā)生反應，導致假陽性結果。先前的研究分別比較了尿液細胞學和BTA檢測的敏感性、特異性，與NMP22檢測一樣，一些良性泌尿生殖系統(tǒng)疾病可能會導致假陽性結果[14]。因此，BTA在臨床上尚不能取代膀胱鏡檢查。在排除泌尿系良性疾病的情況下，隨著腫瘤分期和分級的增加，BTA檢測的靈敏度也隨之升高，然而，與其他非細胞檢測一樣，特異性低于細胞學檢測。

1.3可溶性Fas Fas作為腫瘤壞死因子受體家族的成員之一，參與免疫穩(wěn)態(tài)和免疫監(jiān)視，激發(fā)抑制凋亡信號通路，從而促進炎癥和癌癥的發(fā)生[15]。據(jù)報道，多種惡性腫瘤(如膀胱尿路上皮癌、宮頸癌)患者尿液中可溶性Fas水平均升高，與晚期和高級別患者相比，早期和低級別患者的可溶性Fas水平較高[16]。常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗分析表明，尿液中可溶性Fas水平是膀胱癌復發(fā)和腫瘤進展至浸潤期的預測因子。雖然膀胱癌患者檢測尿液可溶性Fas與NMP22的總體表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義，但靈敏度>75%時可溶性Fas的特異性始終高于NMP22[17]。由于尿液中可溶性Fas的特異性低，可能影響臨床診斷，樣本采集方案和分析需要進一步標準化。

1.4生存素(survivin) survivin是一種小分子蛋白質，屬于凋亡抑制蛋白家族，在腫瘤細胞中大量表達，與預后相關。這種凋亡抑制蛋白在促進癌細胞存活和抑制細胞死亡方面均有作用[18]。survivin信使RNA在胚胎和胎兒發(fā)育過程中選擇性表達，在正常成人組織中檢測不到或低表達，但在癌癥患者中高表達。尿液中survivin基因的蛋白和信使RNA水平均被證明與膀胱癌的發(fā)生、較高的腫瘤分級和晚期病理階段有關，但與腫瘤侵襲性無關[19]。目前已有多種技術和檢測方法用來檢測survivin的信使RNA和蛋白水平，但最常見的方法是斑點雜交(Biodot test，F(xiàn)ujirebio Diagnostics[Malvern，PA])[19]。一項涉及2 051例膀胱癌患者的Meta分析顯示，尿液中survivin診斷膀胱癌的靈敏度為77%，特異度為92%；與免疫組織化學和信使RNA檢測相比，survivin-酶聯(lián)免疫吸附試驗對高級別腫瘤更敏感[20]。

2 基因組生物標志物

2.1端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT) 端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，它介導端粒的復制以維持細胞增殖，在大多數(shù)非腫瘤組織中隨著細胞分裂次數(shù)的增加，端粒會不斷縮短，細胞分裂和增殖受到限制，導致細胞凋亡。相反，端粒延長被認為是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的標志之一[21]。其催化成分TERT是控制端粒酶活性的決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，TERT核心啟動子區(qū)域(C228T和C250T)的突變與人類惡性腫瘤的發(fā)生相關，84%的尿路上皮膀胱癌有TERT啟動子突變[22-23]。TERT啟動子的突變已被確認為膀胱癌復發(fā)最常見的基因改變，與患者的預后及復發(fā)關系密切[24]。從膀胱癌患者的尿液中提取的sDNA和cfDNA均檢測到TERT突變。利用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測膀胱癌患者TERT活性，靈敏度為75%～96%，特異度為69%～96%[25]。但有研究報道，TERT的假陽性率較高[22]，作為膀胱癌標志物仍需要進一步完善。

2.2成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3) FGFR3屬于酪氨酸激酶家族，負責成纖維細胞生長因子信號通路轉導，在細胞的增殖和分化中起調節(jié)作用[26]。有研究報道，F(xiàn)GFR3突變后與腫瘤的形成存在因果關系，F(xiàn)GFR3基因的激活突變是非肌層浸潤性膀胱癌患者最常見的突變基因之一，60%～80%的非肌肉侵襲性尿路上皮性膀胱癌患者有FGFR3突變[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，尿液中FGFR3診斷膀胱癌的靈敏度為39%[27]。FGFR3突變在低級別尿路上皮膀胱癌中更常見，并且與較短的復發(fā)時間顯著相關[28]。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中有70%的FGFR3發(fā)生突變的同時會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)，證明使用非肌肉浸潤性膀胱癌熱點突變進行縱向監(jiān)測是合理的[28]。在肌肉浸潤性膀胱癌中，不同分期的膀胱癌差異較大。因此，肌肉浸潤性膀胱癌標志物的臨床應用需要更多縱向研究來解決其異質性問題。

3 表觀遺傳與轉錄組生物標志物

3.1DNA甲基化 DNA甲基化是最具特征的表觀遺傳現(xiàn)象。在基底細胞癌和癌前病變中發(fā)現(xiàn)了DNA的高甲基化和低甲基化區(qū)域。DNA甲基化狀態(tài)通常發(fā)生在癌變過程的早期，癌癥相關基因的沉默影響癌癥表觀遺傳變化的發(fā)生發(fā)展[29]。在無細胞DNA片段和尿液中脫落的腫瘤細胞中可以檢測DNA甲基化狀態(tài)。高甲基化是尿路上皮膀胱癌的一個共同特征[30]。尿液中的cfDNA片段和腫瘤細胞可以評估DNA甲基化狀態(tài)。與良性患者相比，膀胱癌患者甲基化基因(如結腸腺瘤樣息肉蛋白和細胞周期蛋白D2)的甲基化顯著升高[31]。在尿路上皮癌患者中已發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉移酶P1、結腸腺瘤樣息肉蛋白和視黃酸受體β2基因的高甲基化[32]。有研究表明，對特定位點的1 370個DNA甲基化進行分析可以區(qū)分非浸潤性和肌肉浸潤性尿路上皮癌。近年來，通過對尿路上皮性膀胱癌患者尿沉渣中性別決定區(qū)Y框蛋白1、L1MET(long interspersed nuclear element-1 methylation)和白細胞介素-1受體相關激酶3基因甲基化狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對膀胱癌復發(fā)的預測價值高于尿液細胞學和膀胱鏡檢查[30]。DNA尿液生物標志物有較高的特異性，但這些標志物檢測的條件更為苛刻。由于不同實驗室和不同研究小組對尿甲基化DNA診斷準的準確性不同，其臨床應用需要進一步的技術改進和大規(guī)模的研究驗證。

3.2微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一種短鏈的(21～23個核苷酸)非編碼RNA，通過與信使RNA的3′非翻譯區(qū)配對來調節(jié)基因表達。一些miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中起重要作用[33]。腫瘤組織中miRNA表達具有高度穩(wěn)定性和組織特異性。尿液的上清液或尿沉渣中均含有miRNA，所以尿液是miRNA的較好來源[34]。由于miRNA長度較短，miRNA較RNA鏈更不易降解，可以在室溫下儲存長達48 h。miRNA可以在體液中作為自由循環(huán)的miRNA被發(fā)現(xiàn)，或者與核糖核蛋白結合形成復合物。胞外囊泡的外泌體中也發(fā)現(xiàn)部分miRNA。但研究的方法與操作過程不統(tǒng)一，尿液中miRNA的診斷價值仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌患者尿液的上清液中發(fā)現(xiàn)，miR-99a和miR-125b表達下調；與非腫瘤對照組相比，膀胱癌患者尿液中miR-126水平更高；高級別膀胱癌患者尿液中的miR-146a-5p明顯升，同時miR-200C的低表達與非浸潤性尿路上皮癌的腫瘤進展有關[35]。在肌層浸潤性膀胱癌患者尿液中的miR-618和miR-1255b-5p水平明顯高于對照組[36]。

3.3長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA) lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，存在于血漿、血清和尿液等生物液中，參與調控基因表達或某些表觀遺傳征象。lncRNA的異常調控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[37-38]。有研究顯示，lncRNA水平異常在促進腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[39]。據(jù)報道，膀胱尿路上皮癌細胞系的侵襲、遷移和增殖與結腸癌相關轉錄因子1有關，這可能為臨床預后評估提供一種有效的分級、分期工具。尿沉渣中循環(huán)尿路上皮癌抗原1水平可作為膀胱癌的潛在診斷指標，通過依賴磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑參與膀胱癌的進展。尿路上皮癌相關蛋白1是一種長非編碼RNA，診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為81%和92%[40]。高水平的uc004cox.4 lncRNA可能會降低非浸潤性尿路上皮癌的發(fā)生率[41]。隨著測序技術的普及，癌癥中更多表達有差異的lncRNAs將會被發(fā)現(xiàn)。

3.4信使RNA 循環(huán)信使RNA可在一定程度上反映細胞的狀態(tài)，雖然大多數(shù)循環(huán)中的信使RNA被RNA酶降解，但在癌癥患者中仍然可以檢測到循環(huán)信使RNA[42]。因此，信使RNA被認為是尿液中潛在的生物標志物。膀胱癌患者尿液泛素結合酶E2C和含異亮氨酸谷氨酰胺基序的GTAase激活蛋白的基因水平高于對照組[43]。有研究顯示膀胱癌患者尿液中含有IQ基序的GTP酶激活蛋白3信使RNA表達水平明顯高于對照組，進一步探索發(fā)現(xiàn)，IQ基序的GTP酶激活蛋白3對膀胱癌的侵襲性和病理分級也有較高的診斷準確率，表明IQ基序的GTP酶激活蛋白3可以在肉眼血尿或鏡下血尿的情況下區(qū)分膀胱癌和非膀胱癌患者[44]。此外，尿液中碳酸酐酶9剪接變異體信使RNA可提高尿路上皮性膀胱癌的診斷價值，靈敏度為90%，特異度為72%[45]。總之，信使RNA已顯示出作為惡性腫瘤生物標志物的應用前景，但仍需進一步研究。

4 代謝組生物標志物

外泌體是大部分體液中含有的膜小泡，惡性腫瘤患者的表達水平高于健康人群[46]。外泌體通過轉移不同的生物活性分子(RNA、DNA和蛋白質)參與細胞間的通訊，從而可能影響某些藥物參與的生理反應。外泌體可用于膀胱癌的早期診斷和監(jiān)測，通過觀察尿路上皮膀胱癌患者尿液中外泌體的含量，可以估計患者尿液中存在特定的蛋白質和miRNAs[47]。通過使用microarray平臺和實時熒光定量聚合酶鏈反應分析miR-375和miR146a能在一定程度上區(qū)分尿路上皮膀胱癌是否為高級別腫瘤[48]。此外，蛋白質組學分析顯示，膀胱癌患者尿液中存在腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2，外泌體還可以通過傳遞EGF樣蛋白重復序列和盤狀蛋白1樣結構域促進膀胱癌的進展[49]。膀胱癌患者體內miR-126/miR-152比值增大與膀胱癌的發(fā)生有關[50]。體內代謝生物標志物的表達水平與年齡呈正相關，這為檢測膀胱癌的發(fā)生發(fā)展提供了一種新思路[51]。

5 新興尿液生物標志物

尿液生物標志物的研究旨在提高尿路上皮性膀胱癌診斷的敏感性、特異性和準確性。膀胱特異性核基質蛋白-1和特異性核基質蛋白-4是針對尿路上皮性膀胱癌組織的NMP，不受感染、吸煙、導尿術或膀胱炎等因素的干擾[48]。在血尿患者中，aurora A激酶可以區(qū)分非腫瘤性血尿和低級別尿路上皮性膀胱癌[52]。煙酰胺N-甲基轉移酶在尿路上皮性膀胱癌中高表達，與病理分級有關[53]。無嘌呤/無嘧啶核酸內切酶氧化還原因子-1在尿路上皮性膀胱癌中呈高表達，與腫瘤分級和分期有關，在復發(fā)性膀胱癌中也呈高表達[54]?；罨陌准毎じ椒肿铀脚c膀胱癌患者的分期和總生存率呈正相關[5]。細胞角蛋白20實時熒光定量聚合酶鏈反應診斷尿路上皮性膀胱癌的靈敏度為78%～87%，特異度為56%～80%，提高了腫瘤進展診斷的準確性，但對低級別腫瘤的診斷效能較差[6]。尿液中高水平的細胞角蛋白8和細胞角蛋白18可以通過快速檢測尿路上皮性膀胱癌來區(qū)分高級別和低級別腫瘤[55]。肝細胞生長因子激活因子1和抗上皮細胞黏附分子是高危非肌肉浸潤性膀胱癌患者的預后標志[56]。Snail過表達是非侵襲性尿路上皮性膀胱癌復發(fā)的獨立預后因素[57]。此外，尿糖蛋白作為特定的糖蛋白，可以在低級別和高級別的非浸潤性尿路上皮癌中檢測到，其中高級別肌肉浸潤性膀胱癌患者的尿液CD44升高[58]。一項基于尿蛋白檢測FGFR3/細胞周期蛋白D3的研究顯示，其診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為73%和90%[59]。尿液中含有吲哚丙烯酰甘氨酸、N2-半乳糖醛酸基-賴氨酸和天冬氨酸的代謝產(chǎn)物可以在高級別的膀胱癌中被檢測出來。此外，超高效液相色譜串聯(lián)質譜證實非侵襲性尿路上皮性膀胱癌苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸的代謝途徑發(fā)生了改變[60]。

6 小 結

膀胱癌尿液生物標志物領域發(fā)展迅速，但目前還沒有生物標志物能夠替代膀胱鏡檢查和尿液細胞學檢查。同樣，在多中心臨床研究中，近年發(fā)現(xiàn)的蛋白質組、基因組、表觀基因組、轉錄組和代謝組學作為尿液生物標志物的大量數(shù)據(jù)需要進一步驗證。多靶點生物標志物的使用正逐漸增加，而且這些生物標志物的聯(lián)合使用具有更高的診斷效能。盡管尿液生物標志物的領域不斷擴大，但有限的驗證研究，以及不同組學之間復雜的相互作用，是生物標志物開發(fā)和驗證的重要挑戰(zhàn)。未來的高通量數(shù)據(jù)和復雜的人工智能與新的數(shù)學模型的使用可能給膀胱癌的診斷與監(jiān)測帶來巨大幫助。