未折疊蛋白反應在角膜營養不良中的研究進展

劉學睿，王麗媛，張毅，鄭濤，趙楚楚，劉平

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科，哈爾濱 150001)

角膜營養不良是一類可影響角膜全層，多數類型與遺傳有關的眼病，通常表現為雙側角膜進行性非炎癥性改變，與全身系統性疾病無關[1]。角膜營養不良患者病變初期可無明顯癥狀，但隨著病情的進展，患者可出現視力障礙和(或)眼表刺激癥狀[1]。晚期角膜營養不良患者目前只能通過角膜移植提高視力。盡管部分發達國家的角膜移植手術發展較成熟，供體組織也相對充分，但全球角膜組織供體的日益短缺嚴重限制了其他部分地區角膜移植的治療[2]。此外，角膜移植術后的排斥反應嚴重影響患者的生活質量[3]，這有助于推動替代性、無排斥治療方案的開發。角膜營養不良的發病機制復雜，未折疊蛋白反應、自噬[4-6]、氧化應激[7]等信號通路參與其發病，其中未折疊蛋白反應發揮著關鍵作用。未折疊蛋白反應是一種適應性應激反應，異常折疊的蛋白質聚集于內質網腔時，未折疊蛋白反應通過減少蛋白質的合成，加強蛋白質的折疊和促進蛋白質的降解，從而維持細胞內的蛋白質穩態[8]。當未折疊蛋白反應被持續激活時，將失去其促生存作用而啟動凋亡等信號通路[8]。目前的研究發現，在角膜營養不良中基因突變導致相關的蛋白質異常累積于內質網，并通過持續激活未折疊蛋白反應和隨后的細胞凋亡通路參與疾病的進展[9-12]。現就未折疊蛋白反應在角膜營養不良疾病中的作用進行綜述，為臨床尋找角膜營養不良的非手術治療方案提供分子基礎。

1 未折疊蛋白反應的概述

內質網參與蛋白質轉運，協助、監控蛋白質的修飾、折疊和組裝。分泌蛋白和跨膜蛋白在核糖體上被翻譯后，進入內質網腔中折疊、修飾，其中，正確折疊的蛋白質進入高爾基體，而異常折疊的蛋白質則停留在內質網腔中繼續完成蛋白折疊過程，或者進入內質網相關蛋白降解途徑，通過泛素-蛋白酶體系統被降解。停留在內質網腔中的異常折疊蛋白可刺激內質網從而引起內質網應激，進而激活適應性應激反應，這一過程被稱為未折疊蛋白反應[13]。未折疊蛋白反應由肌醇需求酶1、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶和活化轉錄因子6三種內質網跨膜蛋白啟動。在正常條件下，3種跨膜蛋白通過與結合免疫球蛋白/葡萄糖調節蛋白78結合而保持非活性狀態，當異常折疊的蛋白質積聚在內質網腔時，異常折疊的蛋白與結合免疫球蛋白競爭性結合，導致結合免疫球蛋白與3種跨膜蛋白結合減少，3種跨膜蛋白被激活并進一步誘導隨后的未折疊蛋白反應信號通路[14]。未折疊蛋白反應通過3條通路緩解內質網應激：①激活的蛋白激酶樣內質網激酶使真核起始因子2α磷酸化，從而減少蛋白質合成，減輕內質網負荷；②活化轉錄因子6與結合免疫球蛋白蛋白解離后轉移至高爾基體，然后被位點1蛋白酶和位點2蛋白酶切割后激活，激活的活化轉錄因子6再進入細胞核，激活未折疊蛋白反應相關基因的表達進而恢復蛋白質折疊穩態；③肌醇需求酶1磷酸化后激活其自身RNA酶活性，具有RNA酶活性的肌醇需求酶1對X盒結合蛋白1的信使RNA進行剪接，使信使RNA成熟并編碼X盒結合蛋白1，增強分子伴侶蛋白結合免疫球蛋白等的轉錄活性，緩解內質網應激環境對細胞的損傷。然而，持續的內質網應激會破壞內質網的穩態。當未折疊蛋白反應的緩沖能力不足以恢復內質網蛋白穩態時，CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)基因轉錄被未折疊蛋白反應的3條通路大量激活，并參與其后凋亡通路的調節。未折疊蛋白反應還可以激活內質網膜上的胱天蛋白酶-12，進一步激活胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3，誘導細胞凋亡[15]。

2 未折疊蛋白反應與角膜營養不良

未折疊蛋白反應在許多疾病的發生發展中起關鍵作用，如神經退行性疾病、糖尿病、炎癥等[16]。研究表明，阿爾茨海默病患者神經元細胞中β淀粉樣蛋白異常積聚，可以通過未折疊蛋白反應通路導致神經元損傷和認知障礙[17]。在眼科疾病中，未折疊蛋白反應信號與糖尿病視網膜病變相關，抑制肺癌轉移相關轉錄本1可以減弱內質網應激，從而減輕高糖誘導的人視網膜新生血管形成以及炎癥的發生[18]。此外，未折疊蛋白反應還與白內障[19]、青光眼[20]等相關。近年來，關于未折疊蛋白反應與角膜營養不良的研究成果越來越多，研究重點集中于未折疊蛋白反應及隨后的細胞凋亡通路與角膜營養不良的關系。

2.1未折疊蛋白反應與Fuchs角膜內皮營養不良 Fuchs角膜內皮營養不良是雙側進行性角膜內皮退行性疾病，其特征為漸進性角膜內皮細胞丟失、后彈力層增厚，滴狀贅疣形成，最終導致角膜水腫和視力下降。Fuchs角膜內皮營養不良主要分為早發型和晚發型兩類，早發型主要與Ⅷ型膠原α2鏈基因突變相關[21]，晚發型主要與溶質載體家族4成員11、脂氧化酶同源結構域1、鋅指結構轉錄因子1等基因突變相關[22]。Fuchs角膜內皮營養不良是角膜移植最常見的原因之一[23]，多見于50歲左右女性[24]。組織學分析表明，Fuchs角膜內皮營養不良中受損角膜內皮細胞的死亡形式多為凋亡，由于角膜內皮細胞凋亡的病理生理機制尚不明確[25]，且已有研究表明未折疊蛋白反應參與細胞凋亡過程，由此推測未折疊蛋白反應在Fuchs角膜內皮營養不良的角膜內皮細胞凋亡中起重要作用。Engler等[9]在透射電鏡中觀察到Fuchs角膜內皮營養不良患者角膜內皮細胞的粗面內質網擴張，葡萄糖調節蛋白78、磷酸化的真核起始因子2α、CHOP、胱天蛋白酶-9表達明顯升高，由此提出未折疊蛋白反應激活并導致角膜內皮細胞凋亡在Fuchs角膜內皮營養不良中可能起關鍵作用。

在Fuchs角膜內皮營養不良中，未折疊蛋白反應激活的機制尚不清楚，可能與基因突變相關。Jun等[26]通過敲入突變的Ⅷ型膠原α2鏈基因，構建Fuchs角膜內皮營養不良小鼠模型，觀察發現角膜內皮細胞數量減少，內質網擴張，并檢測到未折疊蛋白反應及其相關凋亡標志物表達明顯上調，表明Ⅷ型膠原α2鏈基因突變可能激活未折疊蛋白反應及其相關凋亡。這可能是因為突變Ⅷ型膠原α2鏈蛋白的二級或三級結構發生改變，導致蛋白質錯誤折疊而積累于內質網，進一步激活未折疊蛋白反應[26]。Fuchs角膜內皮營養不良也可能與其他基因突變相關，如溶質載體家族4成員11基因突變導致其編碼的跨膜蛋白不能正確定位到細胞表面，而累積于內質網[27-28]，脂氧化酶同源結構域1基因突變亦可引起所編碼蛋白沉積于細胞質[29]。綜上所述，基因突變可能導致其編碼的蛋白質異常折疊而不能正確定位，因此異常累積于內質網，并誘導Fuchs角膜內皮營養不良的未折疊蛋白反應及隨后的細胞凋亡。研究發現，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)以及TGF-β受體在Fuchs角膜內皮營養不良的角膜內皮細胞中高表達，并誘導上皮-間充質轉化相關基因鋅指結構轉錄因子1和轉錄因子Snail1過表達，導致Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白等細胞外基質蛋白過度產生[30-31]。過度合成的細胞外基質蛋白積累在內質網中并持續激活內質網應激，通過未折疊蛋白反應觸發內源性凋亡通路[32]。

由于角膜內皮細胞可以通過其代謝性液泵作用使角膜基質保持相對脫水狀態，維持其透明性，Fuchs角膜內皮營養不良中的角膜內皮細胞過度凋亡會損害其泵功能，導致角膜水腫以及視力下降。因此，可以通過抑制過度的角膜內皮細胞凋亡對Fuchs角膜內皮營養不良進行治療。Okumura等[31]研究發現，加入TGF-β受體抑制劑SB431542或使用siRNA敲除TGF-β受體可以抑制TGF-β信號通路，減少未折疊蛋白的產生，從而緩解未折疊蛋白反應以及減少角膜內皮細胞凋亡。

2.2未折疊蛋白反應與顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型 顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型是一種常染色體顯性遺傳病，由TGF-β誘導(transforming growth factor-β-induced，TGFBI)基因中第124密碼子組氨酸取代精氨酸引起[33]，是常見的TGFBI相關角膜營養不良。顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型的特點為突變的TGFBI蛋白在角膜上皮層和基質層中隨年齡增長而逐漸累積，導致角膜混濁及視力下降。但是突變的TGFBI蛋白累積的具體機制尚不清楚，可能與蛋白質分泌減少或降解障礙有關。在蛋白質分泌方面，TGFBI蛋白作為一種細胞外基質蛋白，通過內質網-高爾基體依賴途徑分泌。在顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型患者中，突變的TGFBI蛋白在角膜成纖維細胞中分泌延遲[34]，但具體機制尚不清楚。有研究發現，癌細胞系中核糖體蛋白S3的天冬酰胺165殘基的點突變可影響其自身糖基化，從而減少其通過內質網-高爾基體依賴途徑的分泌[35]。因此，顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型亦可能因為TGFBI基因突變影響蛋白質生物合成后的修飾，導致TGFBI蛋白分泌延遲。突變的TGFBI蛋白修飾改變可能成為未來的研究熱點。在蛋白質降解方面，在內質網應激誘導下，TGFBI蛋白通過內質網相關蛋白降解途徑降解[10]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1和Lin-12樣抑制子/增強子作為內質網相關蛋白降解途徑的重要組成部分，將錯誤折疊的蛋白質轉運至胞質中，并使蛋白質通過泛素-蛋白酶體系統降解[36]。然而，顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型中的Lin-12樣抑制子/增強子表達減少，內質網相關蛋白降解途徑因此存在缺陷，這可能導致突變的TGFBI蛋白積累[37]。此外，顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型角膜成纖維細胞溶酶體功能異常，也可能導致突變的TGFBI蛋白因自噬-降解障礙而異常累積[38]。

在顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型中，異常累積的TGFBI蛋白可能激活未折疊蛋白反應。伴侶蛋白結合免疫球蛋白、蛋白激酶樣內質網激酶和磷酸化蛋白激酶樣內質網激酶、肌醇需求酶1α和磷酸化肌醇需求酶1α、剪接的X盒結合蛋白1顯著上調，證實了未折疊蛋白反應的激活，CHOP表達增加提示未折疊蛋白反應進一步誘導顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型細胞凋亡[10]。體外研究發現，4-苯基丁酸可以通過激活內質網相關蛋白降解途徑增加TGFBI蛋白降解[10]，褪黑素可通過促進內質網腔中蛋白質的糖基化或增加Lin-12樣抑制子/增強子水平減少內質網中TGFBI蛋白的異常累積[37]，且這些藥物均可減輕未折疊蛋白反應的激活。目前的研究表明，突變的TGFBI蛋白可能由于分泌減少或降解障礙，導致其在內質網腔中過度累積，持續激活未折疊蛋白反應并誘導隨后的細胞凋亡通路。因此，在未來的研究中，可以將未折疊蛋白反應作為顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型的治療靶點，通過促進突變TGFBI蛋白正確折疊或增加蛋白質降解，減少突變TGFBI蛋白在內質網腔中的異常累積，緩解內質網壓力，減少顆粒狀角膜營養不良Ⅱ型角膜成纖維細胞凋亡。

2.3未折疊蛋白反應與斑狀角膜營養不良 斑狀角膜營養不良又稱為GroenouwⅡ型角膜營養不良，由Groenouw于1890年首次提出[39]。斑狀角膜營養不良是以雙眼角膜基質進行性混濁為特點的常染色體隱性遺傳性疾病，其特征為角膜早期出現中央基質混濁，并逐漸向周邊延伸，進而導致視力下降。斑狀角膜營養不良發病較早，通常在10歲左右出現角膜基質改變，30歲左右視力嚴重下降[40]。患眼中角膜硫酸角質素的合成減少可導致斑狀角膜營養不良，根據血清和角膜組織中硫酸角質素的含量不同可將斑狀角膜營養不良分為3種免疫表型(Ⅰ型、ⅠA型和Ⅱ型)：斑狀角膜營養不良Ⅰ型患者中，血清以及角膜的上皮層、基質層和內皮層中均無硫酸角質素；斑狀角膜營養不良ⅠA型患者血清中未檢測到硫酸角質素，角膜基質層對硫酸角質素抗體表現出免疫反應性；斑狀角膜營養不良Ⅱ型患者中，血清和角膜基質層中均可檢測到低水平的硫酸角質素，角膜上皮層與角膜內皮層只可檢測到未硫酸化的角質素[40]。Akama等[41]首次發現碳水化合物磺基轉移酶6基因突變可能導致斑狀角膜營養不良。由于碳水化合物磺基轉移酶6基因所編碼的N-乙酰葡萄糖胺-6磺基轉移酶參與角質素的硫酸化，角膜中突變的碳水化合物磺基轉移酶6基因可能導致硫酸角質素合成異常而累積，引起角膜混濁[42]。進一步研究發現，在斑狀角膜營養不良中，異常硫酸化的角質素累積在角膜細胞的粗面內質網[39]，導致粗面內質網擴張[43-44]，角膜基質細胞凋亡增加[45]，由此推測異常合成的硫酸角質素累積在內質網中，持續激活未折疊蛋白反應而誘導角膜基質細胞凋亡。研究發現，斑狀角膜營養不良患者的角膜基質細胞中有大量電子致密顆粒沉積，并檢測出未折疊蛋白反應標志物葡萄糖調節蛋白78、CHOP顯著上調，Bcl-2表達下調，凋亡小體形成，證實了斑狀角膜營養不良中異常蛋白質的累積可導致未折疊蛋白反應以及隨后細胞凋亡通路的激活[11]。雖然大量研究已發現未折疊蛋白反應在斑狀角膜營養不良發病機制中有重要作用，但需要更多研究來探討此過程的具體作用機制，并進一步探索最佳治療方法以延緩甚至阻斷斑狀角膜營養不良的進展。

2.4未折疊蛋白反應與Meesmann角膜營養不良 Meesmann角膜營養不良是角膜上皮一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，其特征是角膜上皮出現小的圓形微囊，最早可在出生時發病。盡管Meesmann角膜營養不良癥狀一般較輕或無癥狀，但有些患者會出現過度流淚、異物感、畏光和視力受損等癥狀，常被誤診為干眼癥。Meesmann角膜營養不良的發病與角蛋白3基因或角蛋白12基因雜合突變相關[46-48]。角蛋白3基因和角蛋白12基因分別編碼特異性角蛋白3和角蛋白12，形成角蛋白3-角蛋白12異二聚體，此異二聚體聚合后形成細胞骨架中間絲，為角膜上皮細胞的結構提供穩定性[49-51]，角蛋白12缺陷小鼠的角膜上皮細胞脆性增加[52]。為了探討基因突變參與Meesmann角膜營養不良的具體機制，Allen等[12]通過敲入突變的角蛋白12基因構建Meesmann角膜營養不良小鼠模型，觀察到角蛋白異常累積在細胞質，并檢測到CHOP和胱天蛋白酶-12明顯上調。上述研究進一步發現，在攜帶突變角蛋白12基因的Meesmann角膜營養不良患者中，未折疊蛋白反應及凋亡同樣被激活，由此提出角蛋白12基因突變可導致所編碼的角蛋白12異常累積，從而誘導未折疊蛋白反應及角膜上皮細胞凋亡。其中角蛋白12基因突變導致角蛋白12異常累積的原因可能是基因突變位于功能關鍵的螺旋起始或螺旋終止基序，導致角蛋白12結構發生顯著改變而不能正確折疊[53-54]。盡管目前許多研究證明未折疊蛋白反應參與Meesmann角膜營養不良的發病，但其相關性和具體機制有待進一步研究證明。Meesmann角膜營養不良是由于基因突變所致，從理論上分析，基因治療Meesmann角膜營養不良是可行的，且目前已有研究證明siRNA沉默的方法可能阻斷角膜上皮細胞突變角蛋白12基因的表達[55-56]，未來可進一步探討siRNA沉默的方法是否可以阻斷未折疊蛋白反應及隨后的角膜上皮細胞凋亡。

3 小 結

角膜營養不良多為遺傳性疾病，與基因突變相關。角膜移植術治療角膜營養不良的研究較多，其相關機制研究相對成熟，但角膜營養不良的非手術治療尚處于初級階段，如細胞治療、分子治療等。目前，研究發現部分角膜營養不良的細胞中存在蛋白質異常累積的現象，當蛋白質過度累積時，可能激活未折疊蛋白反應及隨后的凋亡等相關通路。這些角膜營養不良中未折疊蛋白反應機制的研究已取得顯著進展，為明確角膜營養不良的發病機制和診療提供了新思路。因此，為尋找新的治療方法，未來可以在基因水平和蛋白質水平進行研究，如減少突變蛋白的生成、增加突變蛋白的降解等。