Wnt/β-catenin信號通路在骨質疏松癥和非骨質疏松癥環境下促進成骨的研究進展

李晉蒙，王新濤

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨科，哈爾濱 150081)

骨質疏松癥可以影響骨量的形成和礦物質的產生，以及骨組織結構改變，包括宏觀結構和微觀結構，是一種全身性骨代謝性疾病[1]。骨質疏松癥可以造成骨脆性增加，這是由于成骨細胞活性與破骨細胞活性失衡引起的一種常見骨病，常導致骨折的發生[2]。隨著人口老齡化加劇，骨質疏松癥患者逐漸增多，嚴重威脅老年人的健康。近年通過使用骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)進行的替代療法已被認為是未來治療骨質疏松癥的重要策略[3]。BMSC是骨髓中含量最豐富的細胞，存在于體內結締組織和器官間質[4]。BMSC還具有分化為多種干細胞的潛能，如成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等[5]。BMSC具有快速增殖、分化及取材方便等優點，被廣泛用于骨組織工程的種子細胞[6]。BMSC向成骨細胞分化的過程中涉及多個復雜的信號通路，目前BMSC的成骨機制尚不明確。

Wnt信號通路在BMSC向成骨細胞分化過程中發揮重要作用，Wnt信號通路分為兩類：有β聯蛋白(β-catenin)參與的Wnt經典信號通路(即Wnt/β-catenin信號通路)和無β-catenin參與的非經典Wnt信號通路。經典Wnt信號通路是近年備受關注的信號通路，也是Wnt信號通路中探索最清楚的信號通路，其對BMSC向成骨細胞分化進而促進成骨過程有重要影響。因此，Wnt/β-catenin信號通路被認為是決定間充質干細胞命運的調節因子[7]。此外，Wnt/β-catenin信號通路也是骨質疏松癥治療干預的一個有前景的靶點[8]。隨著對Wnt/β-catenin信號通路研究的不斷深入，發現無論是在骨質疏松癥還是非骨質疏松癥環境下均存在多種物質可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨，進一步證實Wnt/β-catenin信號通路在成骨過程中的重要性。現就Wnt/β-catenin信號通路在骨質疏松癥和非骨質疏松癥環境下促進成骨的研究進展進行綜述。

1 Wnt/β-catenin信號通路概述

1984年Wnt基因被首次發現，Nusse等[9]在小鼠乳腺癌中發現Int-1基因，并且Int-1與Sharma和Chopra[10]在1976年發現的果蠅無翅基因Wingless具有較高的同源性，故將兩個基因合稱為Wnt基因[11]。這是人類首次提出Wnt基因。在2001年，Wnt信號通路被證實與骨量調節有關，因此Wnt信號通路受到骨科界的密切關注[12]。

在Wnt信號通路中，依據是否依賴β-catenin分為Wnt/β-catenin信號通路和非經典Wnt信號通路。經典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin信號通路，其轉導途徑是Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌與細胞膜上受體結合形成復合物，該受體由7次跨膜的卷曲蛋白受體以及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6共同組成，當形成復合物時，復合物活化散亂蛋白，觸發細胞內的信號轉導，進而抑制由糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、結腸癌抑制因子和軸蛋白等構成的蛋白降解復合物，使細胞質中的β-catenin水平增加并進入細胞核，β-catenin與核內轉錄因子T細胞因子/淋巴樣增強因子結合，并特異性地激活下游靶基因轉錄；在沒有Wnt蛋白作用的情況下，β-catenin蛋白在細胞質和細胞核中含量較低或缺失，這是由于β-catenin的N端被GSK-3β、軸蛋白和腸腺瘤性息肉病蛋白組成的復合物磷酸化，進而與泛素蛋白結合，將β-catenin泛素化而降解，GSK-3β可能有多種底物，但在典型的Wnt信號通路背景下，其活性受到包括腸腺瘤性息肉病蛋白和軸蛋白在內的多個蛋白形成復合物的調節[13]。Wnt/β-catenin信號通路中許多蛋白表達水平均可影響BMSC向成骨細胞分化的過程。Gong等[12]研究發現低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因突變可以影響成骨，導致骨質疏松癥或骨化癥，這也首次揭示了Wnt/β-catenin信號通路對骨發育起著至關重要的作用。

Wnt/β-catenin信號通路對成骨各個階段的影響也不同。在早期階段，β-catenin的表達可以調控BMSC分化為破骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞等，同時，還對早期成骨標志物(如堿性磷酸酶、Runt相關轉錄因子2)的表達產生影響，β-catenin在早期的活化也促進了成骨細胞的增殖；在后期，β-catenin信號下調是成骨細胞分化和骨鈣素表達所必需的，因此，Wnt/β-catenin信號通路對骨骼的再生和骨骼的發育過程有重要影響[14]。除經典 Wnt信號通路外，Wnt蛋白還可以通過不同受體誘導非經典Wnt信號轉導通路，這些非經典Wnt信號通路較Wnt/β-catenin信號通路更加繁雜，包括的信號通路種類眾多，常見的有Wnt/Ca2+通路、Wnt/c-Jun氨基端激酶通路和Wnt/Ror2通路等[15]。

2 Wnt/β-catenin信號通路在骨質疏松癥中的作用

2.1骨質疏松內環境下β-catenin的改變 骨質疏松癥是一種常見的退行性疾病，主要影響高齡女性，近年的一項研究表明，50歲以上的男性中有16%患有骨質疏松癥，而50歲以上的女性中有29.9%患有骨質疏松癥[2]，尤其是絕經后女性，是骨質疏松癥患者的高發人群。Shi等[16]分析了絕經后骨質疏松癥患者的BMSC，發現轉錄β-catenin的CTNNB1(Catenin beta 1)基因明顯低于健康對照細胞，同時，實時熒光定量聚合酶鏈反應和蛋白質印跡(Western blot)結果顯示，在BMSC成骨分化過程中CTNNB1的mRNA和蛋白表達水平升高。在骨質疏松癥患者中，2型糖尿病也是導致骨質疏松癥的危險因素之一。Li等[17]研究發現2型糖尿病導致的骨質疏松主要是由于骨形成受損所致而不是骨吸收增加，在2型糖尿病中骨吸收和骨形成的變化程度不同，導致骨質疏松癥的發生；同時還發現在骨和干細胞等外周組織中表達的腦和肌肉芳香烴受體核轉位蛋白1在2型糖尿病中表達降低，通過增加芳香烴受體核轉位蛋白1的表達可抑制Wnt/β-catenin信號轉導通路中GSK-3β的表達，進而顯著改善BMSC驅動的骨再生；相反，增加芳香烴受體核轉位蛋白1表達可抑制GSK-3β并啟動Wnt/β-catenin通路，顯著改善BMSC驅動的骨再生。Dong等[2]發現用于治療2型糖尿病的安奈格列汀具有治療骨質疏松癥的潛在作用，安奈格列汀可通過Wnt/β-catenin信號通路顯著增加MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化和礦化，以及成骨關鍵因子重組人骨形態發生蛋白-2和Runt相關轉錄因子2的表達。

2.2骨質疏松內環境下體內外物質通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨 在骨質疏松的內環境下，許多體內外物質可以通過Wnt/β-catenin信號通路影響成骨。Yang等[8]研究發現普遍存在于細胞外基質的纖維連接蛋白1(fibronectin 1，FN-1)可以通過Wnt/β-catenin信號通路影響骨質疏松癥患者的成骨，FN-1與β-catenin在體外相互作用和調節，FN-1過表達可以啟動Wnt/β-catenin信號通路，進而促進成骨細胞的分化和成骨；此外，研究還發現整合素β1可與FN-1相互作用，且整合素β1對FN-1介導的Wnt/β-catenin信號通路的激活是必不可少的。Oh等[18]研究發現采用Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)預處理可抑制海產品中赤貝蛋白衍生肽AWLNH和PHDL誘導的堿性磷酸酶活化和鈣化，而DKK-1也可降低Wnt信號分子的mRNA表達，提示AWLNH和PHDL可以通過典型的Wnt/β-catenin信號通路促進BMSC向成骨細胞分化。Liu等[19]在去卵巢大鼠和原代成骨細胞中分別給予女貞子水提取物和含藥血清，結果首次證明女貞子可以抑制去卵巢大鼠和原代成骨細胞中DKK1和骨硬化素過表達，進而誘導典型的Wnt/β-catenin信號通路來保持骨質量，表明女貞子可能為預防骨質疏松癥的新來源。Chen等[1]研究發現鳶尾素在人類血液循環中的水平與骨質疏松性癥有關，鳶尾素可能通過增加自噬相關蛋白12-自噬相關蛋白5-自噬相關蛋白16L復合物而上調BMSC自噬，進而提高BMSC的成骨分化能力；此外，結果還表明，在鳶尾素誘導BMSC自噬后，Wnt/β-catenin信號通路被激活，促進成骨；而BMSC自噬被抑制時則出現相反的結果。

3 Wnt/β-catenin信號通路在非骨質疏松癥中的作用

3.1體內物質通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨 Wnt/β-catenin信號通路在小鼠和人的骨再生和改建過程中起重要作用。Wnt/β-catenin信號通路已成為骨代謝的重要信號通路，幾乎影響骨骼生理學的各個方面。Liu等[20]實驗發現，Wnt信號通路的激活可促進微循環的形成，特別是促進血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶9的表達，進而促進成年和老年雄性小鼠干骺端的骨折愈合。Liu等[21]發現分布于骨髓和血管中的感覺神經纖維分泌的神經肽Y可以促進間充質干細胞向成骨細胞分化，上調和促進β-catenin的表達，此外，神經肽還可促進β-catenin向細胞核內移位，表明神經肽可能通過激活典型的Wnt/β-catenin信號通路介導BMSC向成骨細胞分化。Shi等[22]實驗發現血管活性腸肽可通過激活經典Wnt信號通路促進BMSC在體外成骨和促進血管生成及分化，并通過激活經典Wnt信號轉導通路刺激體內骨修復功能。Shares等[23]發現活躍的線粒體通過促進β-catenin乙酰化從而促進成骨細胞分化。

在人體中，許多基因也可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨。Lang等[24]證實miR-25基因在骨折大鼠中通過激活Wnt信號通路而過表達，進一步促進骨折愈合。Zhang等[14]實驗證實miR-335-5p基因在體內和體外均能抑制Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑DKK-1的表達，進而促進BMSC向成骨細胞分化。Mulati等[25]發現在人類各種癌癥中均有lncRNAs結直腸腫瘤差異表達基因的過表達，該基因可以在體內外促進BMSC向成骨細胞分化，并在體內調節成骨細胞的增殖。Liu等[26]發現在成骨祖細胞中高表達的G蛋白偶聯受體可通過穩定β-catenin來激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進成骨分化和礦化；相反，G蛋白偶聯受體基因敲除通過促進β-catenin的降解，使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制成骨分化和礦化。

Wnt/β-catenin信號通路被認為是成骨細胞分化的主要調節因子，也是脂肪細胞分化的抑制因子。Wnt/β-catenin信號通路可以通過抑制BMSC向脂肪細胞的分化而促進向成骨細胞分化。Jeong等[27]發現具有破骨細胞功能的重要調節因子跨膜蛋白64基因在小鼠體內被敲除后，可以顯著增加成骨細胞的數量，減少BMSC向成脂細胞分化，還可提高胞質內β-catenin的表達水平，進而導致β-catenin向核內轉移增多；相反，跨膜蛋白64過表達可抑制BMSC向成骨細胞分化進而加速向脂肪細胞的分化，并抑制β-catenin表達。Pan等[28]實驗發現Yes相關蛋白具有促進成骨和抑制脂肪細胞生成的作用，并揭示了Yes相關蛋白在成人成骨和骨穩態過程中對β-catenin信號的正向調節作用。Luo等[29]發現Runt相關轉錄因子1通過經典Wnt信號通路促進BMSC向成骨細胞分化，并且可以抑制BMSC向脂肪細胞分化。

3.2體外物質通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨 體外物質也可以通過Wnt/β-catenin信號通路影響成骨，如許多金屬材料可以通過經典的Wnt信號通路促進成骨。Hung等[30]證實Mg2+通過激活經典的Wnt信號通路在骨髓腔誘導成骨效應，進而導致BMSC向成骨細胞分化。Abuna等[31]發現生長于納米鈦上的細胞可通過干擾Wnt/β-catenin信號通路中的卷曲蛋白4基因表達，進而促進成骨細胞分化。無機非金屬材料硅磷酸鈣(Si-CaP)具有良好的生物相容性和生物降解性，其成分與人骨中的無機成分非常接近[32]。Cameron等[33]實驗發現Si-CaP可促進BMSC的附著和增殖，且與單純羥基磷灰石相比，Si-CaP促進成骨的能力更強，Si-CaP在體外可增加骨基質的產生，在體內表現為更強的促進成骨作用。當硅濃度為0.8wt%時，Si-CaP促進成骨分化的能力最強[32]。Han等[34]實驗結果表明，Si在調節BMSC增殖和Wnt/β-catenin信號通路中起重要作用。而Si-CaP是由Si取代了CaP中的一個磷離子，所以推測Si-CaP也可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進BMSC向成骨細胞分化，但還需進一步證實。

除金屬材料外，許多中藥物質也可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨。Sharma和Nam[35]實驗證實，山柰酚可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞分化。Zhao等[36]實驗證實GSK3-β的特異性抑制劑溴-靛玉紅-3′-肟可以促進β-catenin進入細胞核進而在細胞核內積聚，從而激活Wnt/β-catenin信號轉導通路。在中藥方面也有相關報道，Zhou等[37]發現中草藥物苔黑酚葡萄糖苷可以通過Wnt/β-catenin信號通路在體外促進BMSC向成骨細胞分化，還可以抑制BMSC向成脂細胞分化。Zhu等[38]實驗證明梓醇可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進BMSC向成骨細胞的分化。Mo等[39]研究發現老鸛草素可以提高細胞核內β-catenin的表達水平，這是其成骨作用的重要機制。

4 結 語

骨質疏松癥是全球老年人普遍存在的一種疾病，在骨質疏松癥內環境下促進成骨是學者們研究的難題之一。成骨過程中涉及許多信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路是促進成骨過程中不可或缺的通路。在骨質疏松癥環境下，可導致Wnt/β-catenin信號通路中的一些蛋白表達發生改變，進而影響成骨。在治療方面，學者們發現無論是體內的一些基因還是體外的藥物甚至一些金屬離子都可以通過Wnt/β-catenin信號通路影響成骨。相信隨著研究深入，Wnt/β-catenin信號通路對于骨科疾病的治療也會起到關鍵作用。但是目前β-catenin與T細胞因子/淋巴樣增強因子結合后作用的下游靶基因尚未研究清楚。還有研究指出Wnt/β-catenin信號過度激活可能導致BMSC衰老[40]，但最終成骨機制尚不明確。同時，Wnt/β-catenin信號通路成骨過程中涉及的蛋白眾多，仍有待深入研究。