TGF-β/Smad通路在糖尿病視網膜纖維化中的研究進展

崔歌，楊志鴻，王曉妍，章宗籍，鄒英鷹

(昆明醫科大學基礎醫學院病理學與病理生理學系，昆明 650500)

目前中國有超過1億糖尿病患者，且以平均每天3 000人，每年120萬人的速度遞增[1]。隨著糖尿病的發展，預計到2030年糖尿病性視網膜病的發病率在發展中國家將增加69%，在發達國家將增加20%[2]。據統計，糖尿病患者平均7～10年發展為糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)，而患糖尿病20年后幾乎全部發展為DR[3]。DR若未得到及時治療，則會發生視網膜脫落，嚴重者致盲，不僅降低患者生活質量，還嚴重影響身體健康[4-5]。DR可分為兩個階段：非增殖性DR和晚期增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，當DR發展為PDR時，視網膜表面血管生成和隨后發生的纖維化通常會導致纖維血管的形成，最終形成纖維血管膜，即形成糖尿病視網膜纖維化[6]，而纖維血管膜的收縮牽拉引起的玻璃體積血及視網膜脫離是PDR導致患者視力下降甚至失明的主要原因。目前PDR的治療方法主要為對高血壓、高血糖和高血脂等危險因素的控制，以及激光光凝術和部分藥物治療，如抗血管內皮生長因子制劑、皮質類固醇等[7-11]，但均未能有效治療糖尿病所致的視網膜纖維化，因此了解糖尿病視網膜纖維化形成機制以及選擇相關治療靶點顯得尤為重要。目前，糖尿病視網膜纖維化發病機制尚不清楚。有研究證明，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β與DR的發生、發展密切相關，TGF-β/Smad通路的激活在調節眼組織血管生成、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成和炎癥細胞因子的表達中起重要作用[12-13]。現就TGF-β/Smad通路在糖尿病視網膜纖維化中的研究進展予以綜述。

1 糖尿病視網膜纖維化的形成

在幾種慢性疾病中，類似于惡性腫瘤中上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程，ECM蛋白產量增加和纖維化過程，內皮表型改變，即內皮-間充質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)已得到證實[14-16]，這種EndMT過程在某些慢性糖尿病并發癥中尤為重要。EndMT影響成纖維細胞和肌成纖維細胞的發育，與纖維化的進展和PDR的發展有關[17]；且有證據顯示，EndMT形成過程與EMT的發生發展過程相似，并由Smad依賴性和非Smad依賴性信號轉導通路介導，由TGF-β蛋白質超家族(包括TGF-β1和TGF-β2)調控[15-16]。高血糖誘導的ECM積累是DR的主要標志[18]，而細胞增殖、ECM伸展和新生血管形成是PDR形成的關鍵[19]。在視網膜纖維化的早期階段，新血管異常增生，沒有纖維化組織，進入中間階段后，半透明的纖維化結締組織逐漸填充血管間隙，導致在后期形成密集的白色無血管瘢痕。纖維血管增生組織從其起源向周圍擴展，而無血管增生組織通常是從纖維血管增生邊緣延伸的薄膜，在這一系列纖維組織形成過程中纖維化產生的牽引力導致內部神經感覺視網膜與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)分離，從而導致視網膜脫離。而新生血管的生長伴隨ECM堆積，形成延伸到玻璃體內的纖維血管膜，促進視網膜表面或玻璃體腔內纖維化組織的形成[6,20]。有研究表明，TGF-β1可使增殖的RPE失去極性，發生EMT，從而增加纖連蛋白、膠原等主要ECM蛋白以及其他大量膠原蛋白的ECM成分[21]，引起糖尿病視網膜纖維化。

2 TGF-β的分子結構

TGF具有廣泛的生理和病理作用，屬于具有免疫調節特性的TGF家族[22]。在哺乳動物中已經發現3種TGF-β亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，三者均由112個氨基酸組成，生物學作用相似，其編碼基因分別定位于染色體19q3、1q41和14q24上[23-24]。其中，TGF-β1存在于內皮細胞、造血細胞和結締組織細胞中，TGF-β2存在于上皮組織和神經元中，TGF-β3存在于結締組織細胞中[25-27]。TGF-β1以生物學上無活性的形式分泌，并以分子量為290 000的復合物形式存儲在ECM中，其含有C端生長因子(成熟的TGF-β同型二聚體)及其前肽[稱為潛伏期相關肽(latency-associated peptide，LAP)]。LAP是一種二硫鍵連接的二聚體，可調節TGF-β1在整個纖維化發展過程和維持組織穩態中發揮關鍵作用，其與TGF-β1非共價結合為潛伏TGF-β1，阻止TGF-β與細胞表面受體結合并啟動信號通路；成熟的TGF-β1同型二聚體從LAP上解離對于生長因子激活和獲得生物活性是必需的，病毒性糖苷水解酶、蛋白酶和細胞黏附蛋白通過靶向LAP，誘導LAP發生大規模構象變化，釋放TGF-β1。此外，潛伏性TGF-β結合蛋白對大潛在復合物(large latent complex，LLC)的有效分泌表現出重要作用，主要將分泌的TGF定位在ECM發生區域。而炎癥損傷等誘導ECM的發生，并增加局部細胞外潛伏的TGF-β的儲存，同時也刺激了廣泛的分子信號，介導成熟的生物活性TGF-β從LLC中釋放出來，當從LLC分離后，TGF-β被整合素、蛋白酶-纖溶酶、高血糖、活性氧類或極端溫度、低pH值和氧化等激活，這個過程為TGF-β的活化[28-30]。

3 TGF-β的調控及Smad通路

活化的TGF-β由Ⅰ型和Ⅱ型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體組成的異構復合體傳遞，在人類中存在7個 Ⅰ 型受體和5個 Ⅱ 型受體，包括TGF-β Ⅱ 型受體和骨形態發生蛋白受體2以及 Ⅰ 型受體活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinase，ALK)(ALK1～7)[25]，其中ALK5也稱為TGF-βⅠ型受體[25,27]，根據它們磷酸化受體的不同可分為受體調節型Smads、共同通路型Smads和抑制型Smads，其中受體調節型Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8[31-32]。Ⅰ型受體可以進一步分為兩個亞群，一類是對TGF-β樣蛋白反應而激活Smad2和Smad3的受體，另一類是對骨形態發生蛋白反應而激活Smad1、Smad5和Smad8的受體，激活的受體通過經典的Smad依賴性通路或非Smad依賴性通路將細胞外信號從細胞表面跨膜受體傳遞到細胞核，這兩條通路均參與了TGF-β誘導的肌成纖維細胞的分化。可見，Smad蛋白在纖維化中起不同的作用，一些Smad發揮促纖維化作用，而其他Smad發揮抗纖維化作用[33]。

3.1經典Smad依賴性信號通路 在經典Smad依賴性信號通路中，TGF-β Ⅱ 型受體二聚體和TGF-β Ⅰ 型受體二聚體均與TGF-β配體結合形成復合物，對TGF-βⅠ型受體的GS結構域磷酸化，并磷酸化TGF-βⅠ型受體(ALK5)的絲/蘇氨酸殘基，進而磷酸化下游的轉錄因子Smad2和Smad3[34-36]。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復合體，轉入細胞核內，多種非Smad共激活子(如組蛋白乙酰轉移酶p300、激活蛋白-1、轉錄因子Sp-1和cAMP反應元件結合蛋白)和共抑制因子(如Ski原癌基因、SnoN蛋白和Smad核相互作用蛋白1)結合到含有Smad3的復合體上，從而影響不同基因的轉錄[25]；同時，磷酸化的Smad3激活ECM和α平滑肌肌動蛋白的轉錄，引起纖維化的發生。有研究顯示，在動物模型中，ALK5的藥理抑制作用通過ALK5-Smad3軸減弱了肝臟、腎臟、心臟、腸、脈管系統等的纖維化重構[37-41]，但有關其在糖尿病視網膜纖維化中的發病機制研究較少。此外，TGF-β配體結合ALK1和TGF-βⅡ型受體復合物，進而磷酸化激活Smad1、Smad5和Smad8的受體，激活后的Smad1、Smad5和Smad8與Smad4結合轉位進入細胞核調控不同于Smad2/3/4復合物的靶基因轉錄[42]。但目前有關ALK1-Smad1-Smad5軸信號轉導在纖維化中潛在作用的研究較少，且與糖尿病視網膜纖維化相關的研究更少。抑制型Smads主要包括Smad6、Smad7，其中Smad7是經典Smad信號通路的抑制劑，其與Samd2、Smad3競爭結合激活TGF-β Ⅰ 型受體和隨后信號[43]。因此，可以在促進纖維化型Smads和抗纖維化型Smads之間取得平衡來進行抗纖維化治療。

3.2非Smad依賴性信號通路 除經典Smad依賴性信號通路外，TGF-β還可通過非經典的信號通路(即非Smad依賴性信號通路)調控糖尿病視網膜纖維化[44]。在Smad依賴性信號通路介導的TGF-β信號機制的背景下，激活的受體也可通過促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路傳遞信號，包括胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基端激酶、p38 MAPK、IκB激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B，以及Rho家族鳥苷三磷酸酶，通過相關激酶激活引起非Smad依賴性信號通路作為獨立通路或與Smads合作，然后整合到經典Smad依賴性信號通路上控制Smad活動，進而在多種細胞功能中發揮重要作用[45]。經典Smad依賴性信號通路和非Smad依賴性信號通路之間雖有相互作用，但在介導TGF-β所致的ECM沉積與纖維化中的相互作用尚不清楚。

4 TGF-β/Smad通路與糖尿病視網膜纖維化

TGF-β是關鍵的纖維化因子，與糖尿病并發癥(如糖尿病腎病)有關。在胚胎發育和成人組織中，已經證明了眼中的TGF-β及其受體的表達[16]。經檢測，PDR患者玻璃體液中的TGF-β2水平較無糖尿病患者高[6]，且TGF-β是EMT最有效的誘導劑[46-47]。TGF-β1經眼組織中的高糖刺激，可以異常高表達，從而傳遞細胞信號以發揮其生物學作用，尤其是對下游Smad3的強烈刺激作用，Smad3被激活并進一步磷酸化。磷酸化Smad3進入細胞核以傳輸細胞信號并使許多轉錄因子轉錄，從而進一步誘導視網膜纖維化。微RNA(microRNA，miRNA/miR)-21是一種非編碼RNA，已被證實與多種疾病的發作有密切聯系，能夠調節多種細胞信號通路，從而對疾病的多種病理反應產生重要影響。有研究表明，DR模型大鼠視網膜組織中的miR-21表達水平明顯高于正常大鼠，而TGF-β/Smad信號通路抑制劑顯著減弱了miR-21在DR模型大鼠中的作用，并改善了DR模型大鼠的眼血流動力學，表明miR-21通過調節TGF-β/Smad信號通路參與糖尿病視網膜纖維化的發生[48]。有研究表明,高糖誘發糖尿病性心肌病以及EndMT，而miR-142-3p對TGF-β1具有直接調控作用，可抑制TGF-β1-Smad通路引起的EndMT，且TGF-β1是內皮細胞miR-142-3p的下游靶基因[49]，但在高糖誘發的糖尿病視網膜纖維化中miR-142-3p是否有類似作用尚不清楚。實驗表明，高糖通過Smad2引起TGF-β的信使RNA上調，當使用TGF-β1抑制劑(SB431542)處理后，可防止葡萄糖誘導的ECM相關蛋白質表達水平的升高以及Smad通路的激活[50]。Smad2是miR-200b的靶標[14],高糖誘導的EndMT與miR-200b的下調以及轉錄共激活因子p300 的上調相關，并伴隨TGF-β/Smad信號通路的激活和ECM蛋白水平的提高。Feng等[51]使用miR-200b內皮特異性過表達的轉基因小鼠后進行實驗，結果顯示ECM相關蛋白表達水平降低。而在高糖誘導的視網膜內皮細胞EndMT的過程中，TGF-β起關鍵作用，且這些變化受miR-200b和轉錄共激活因子p300調控，從而為基于TGF-β/Smad通路誘導所致的糖尿病視網膜纖維化提供了新思路。

有文獻報道，DR患者血漿心肌梗死相關轉錄長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA of myocardial infarction associated transcript，lncRNA-MIAT)表達增加，其可作為提示患者發生DR的標志物，且lncRNA-MIAT通過激活TGF-β1信號通路[52]，從而引起糖尿病視網膜纖維化，因此lncRNA-MIAT對TGF-β信號通路的調節作用可能成為治療DR的靶點。此外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通過靶向包括TGF-β在內的多種信號轉導通路，調節EMT在癌癥轉移中發揮重要作用[53]。Thomas等[44]闡述了lncRNA H19在高糖誘導的EndMT中的作用。lncRNA H19通過非Smad依賴性信號通路的MAPK-ERK1/2通路抑制高糖引起的TGF-β1介導的EndMT，而lncRNA H19是否可通過經典Smad依賴性信號通路調節糖尿病視網膜纖維化有待進一步探討。可見，lncRNA通過經典Smad依賴性信號通路與非Smad依賴性信號通路參與高糖引起的EndMT，且lncRNA-MIAT可作為DR的潛在診斷標志物，為開發DR臨床診斷方法和治療目標提供新思路。

另有研究表明，在TGF-β誘導的人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中TGF-β受體2表達水平升高，且典型的間充質標志物(包括α平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白和波形蛋白)表達顯著增加，實驗中使用MG132(一種有效的特異性蛋白酶體抑制劑)可導致泛素化蛋白的劑量依賴性和時間依賴性累積[54]，MG132顯著抑制TGF-β誘導的Smad2、ERK1/2磷酸化，其對TGF-β的信號調節，歸因于TGF-β受體2表達減少，從而抑制人RPE系和原代人RPE的增殖、遷移和EndMT。該研究證明，蛋白酶體抑制劑MG132誘導的蛋白毒性應激可以抑制人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中的EMT過程，提示蛋白酶體抑制劑或可成為難治性視網膜纖維化疾病(如增生性玻璃體病變和PDR)的治療方法。

以上研究表明，TGF-β是纖維化的誘導因素，是參與糖尿病視網膜纖維化過程的一種重要細胞因子，在纖維化發生發展過程參與多種通路，其中TGF-β/Smad信號轉導通路已經成為治療糖尿病視網膜纖維化的關鍵靶點，其相關通路的基因靶點可成為糖尿病視網膜纖維化的潛在靶點。

5 小 結

DR通常發展為慢性或不受控制的糖尿病并發癥，目前通過常規眼科檢查進行評估。其治療方法主要為激光療法，但目前可用的DR治療策略僅適用于晚期患者，且被報道會發生嚴重的不良反應[55]。糖尿病視網膜纖維化的發生發展涉及多個階段，雖然在整個疾病發展過程中TGF-β信號均參與其中，但TGF-β超家族成員在糖尿病視網膜纖維化中的作用尚不清楚，從而需要特定的糖尿病動物模型，重點關注視網膜中TGF-β信號參與的各個方面，以為尋找TGF-β/Smad信號通路上相關作用靶點和相關因子的抑制藥物提供新思路。隨著研究人員對相關機制研究的不斷深入，今后會有更多的抗糖尿病視網膜纖維化靶點以及藥物被發現，從而為治療DR提供新思路。