富血小板血漿的臨床應用

馬婉茹 聶志揚 胡俊華

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）的采集是指將血漿中血小板濃縮到高于全血中血小板水平的方法。PRP是血小板濃度達到患者自身血小板濃度的3～6倍時，利用全血成分沉降系數的不同從而離心得到的血小板血漿，其中含有多種促進組織修復和再生的細胞因子等生物活性物質，目前已經成為再生醫學治療中的重要部分[1]。PRP中血小板被激活后可以釋放多種生長因子，白介素和其他細胞因子。豐富的細胞因子具有抗炎、趨化、抗凋亡和促進細胞增殖的作用，改變受損部位的微環境，減輕疼痛并加快組織的愈合和再生[2-3]。同時PRP的易于獲取、無免疫排斥反應、無創性等優點均促進了PRP臨床應用的增加[4]。

1 PRP的生理特征 血小板來源于骨髓巨核細胞的細胞質并以圓盤狀無核小顆粒的形式存在，它的主要功能是參與生理性止血，促進血塊收縮和維持血管內皮的完整性[5]。血小板細胞質內含有儲存顆粒-α顆粒和致密體等，受到刺激后將儲存在α顆粒、致密體或溶酶體內的物質排出的現象，稱為血小板釋放或血小板分泌。血小板儲存顆粒包括合成代謝因子（血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor [PDGF]-AA，-BB，and -AB），轉化生長因子β因子（transforming growth factor-β，TGF-β），血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1），分解代謝因子（白細胞介素-1b（interleukin-1b，IL-1b））和基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）和分解代謝阻斷劑（IL-1受體拮抗劑）[6]。血小板可維持血管壁的完整性，其釋放的VEGF和PDGF等可促進血管內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖，也有利于受損血管的修復。此外，被釋放的物質除了來自于血小板顆粒外，也可以來源于臨時合成并即時釋放的物質，如血栓烷A2（TXA2），能引起血小板聚集的因素，多數也能引起血小板釋放反應。最近的研究將血小板功能擴展到通過釋放趨化因子、細胞因子和一些免疫調節配體（例如CD154）來調節局部炎癥事件，血小板可以通過CD154在體內外誘導樹突狀細胞成熟、B細胞等型轉換和增強CD8+T細胞反應。有血小板輸注研究表明，在病毒感染過程中，單用血小板源性的CD154可以增強T淋巴細胞的功能，從而增強對病毒再激發的保護作用[7-8]。上述血小板功能的研究提示PRP可能對免疫細胞也發揮一定作用。PRP中除了含有血小板以外，也含有白細胞成分。白細胞是炎癥反應、宿主抵抗感染原和傷口愈合的重要介質。其中，中性粒細胞參與傷口愈合，單核細胞和巨噬細胞通過清除受損細胞來促進組織修復[9]。因此白細胞的存在可能會導致促炎性細胞信號傳導和局部組織分解代謝，從而與PRP治療的預期愈合效果相反。肌腱模型的體外研究表明，降低PRP中的白細胞濃度可以降低炎癥反應，這可能比最大限度地提高血小板濃度以優化PRP療效更為重要[10-13]。PRP采集的離心過程會減少或消除紅細胞的存在。紅細胞的主要功能是攜帶氧氣，對于組織修復至關重要，但是紅細胞釋放的一氧化氮介導了軟骨組織對類胰島素生長因子-1（insulin-like growth factors -1，IGF-1）的不敏感性[14]。在應激條件下，紅細胞內的血紅蛋白分子所含的鐵催化自由基有助于病原體的破環，但是自由基也可以在促炎性信號反應中誘導宿主細胞凋亡。因此PRP中紅細胞的含量需要進一步探討[9，15]。

2 PRP的制備和分類 PRP手工制備一般采用自體靜脈血兩步離心的方法。采集患者靜脈血5 mL，并在存在抗凝劑的情況下，以460 g轉速離心8～10 min，通過第一次的離心，血液從頂部到底部分為三層：（1）貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）（2）血沉棕黃層（buffy coat，BC）（3）紅細胞層（red blood cells，RBCs）。將PPP和淺表的BC轉移到新的試管中以3 000 g轉速離心10 min，丟棄PPP后獲得終產品PRP，包含整個BC，其中大部分的血小板、白細胞和殘留的極少RBCs懸浮在富含纖維蛋白的血漿中[16]。除手工制備PRP以外，血細胞分離機也被用于制備自體PRP。相較于手工制備PRP，機采制備PRP的優點包括：（1）白細胞以及紅細胞清除率達99%以上。（2）臨床醫生可以根據患者自身血小板濃度靈活設定PRP濃度，保證PRP的治療療效。（3）一次采集可以供多次使用，滿足患者短時間多療程的需求。PRP的制備有多種方法，無論何種方式制備PRP，都需要對其進行質量檢測，包括血小板計數、生長因子濃度、有無細菌污染及有無沉淀等。研究者應根據自己的實際情況選擇適當的方法，并使用獲得國家Ⅲ類醫療器械注冊證的衛生材料和在封閉狀態下分離制備。中國輸血協會輸血管理學專業委員會在2021年推出了PRP制備技術規范化和制品質量控制的專家共識，專家們對PRP制備人員條件、材料要求、設備等均做出了要求，并推薦成分血單采機采集制備為首選方法[17]。

近年來，不同研究者根據PRP成分的不同對PRP進行分類。Dohan Ehrenfest分類依據白細胞和纖維蛋白存在與否將PRP分為4類：（1）純PRP或者貧白細胞PRP：活化后纖維蛋白網絡密度低并且無白細胞水平或者低白細胞水平。（2）富白細胞的PRP：活化后纖維蛋白網絡密度低并且白細胞水平相對較高。這兩類PRP都可以以液態或者活化的凝膠形式存在。（3）富血小板纖維蛋白或者貧白細胞的富血小板纖維蛋白：活化后纖維蛋白網絡密度高并且無白細胞水平或者低白細胞水平。（4）富白細胞血小板纖維蛋白：活化后纖維蛋白網絡密度高并且白細胞水平也相對較高。這兩類PRP只能以凝膠的形式存在[16]。

DeLong等人描述了血小板、活化和白細胞（platelet，activation，white blood cells，PAW）的系統。PAW分類是以血小板數量、血小板激活方式和白細胞存在與否為依據。（1）血小板濃度分為P1（≤基礎值），P2（基礎值～7.5×105個/μL），P3（7.5×105個/μL～1.25×106個/μL）和P4（＞1.25×106個/μL）。（2）總白細胞含量，分為高于或低于/等于基線水平，如果BC層包含中性粒細胞則是高于基線水平，如果BC層不包含中性粒細胞則是低于基線水平。（3）活化條件[18]。這個分類相較于Dohan Ehrenfest分類而言，研究者對于血小板的數量做了絕對定量并且考慮了中性粒細胞在PRP中的作用。2015年，MAUTNER等研究者強調了紅細胞對于PRP活性的作用，將PRP的分類系統命名為PLRA（platelet、leucocyte、RBCs、activation），根據血小板的絕對數量，白細胞的濃度，中性粒細胞的百分比，紅細胞含量和外源性激活物的存在對PRP進行劃分[19]。之后，DEPA分類更是納入了PRP產物的有效性，這與PRP中血小板比例相對應，也更加強調PRP純度的重要性[20]。隨著機采血小板的廣泛應用，MARSPILL分類也包含了采集PRP的方式和離心轉速次數[21]。因此，研究者將PRP分類因素總結如下：（1）方法：手工或者機采；（2）活化：PRP是否被激活；（3）RBCs：較高或者較低，較低水平是比基礎水平減少15倍；（4）轉速：PRP采集是一步離心或者兩步離心；（5）血小板濃度：分類為高于基礎值的2～3倍，4～6倍，6～8倍，8～10倍；（6）影像指導：有或者無指導；（7）白細胞：富白細胞PRP或貧白細胞PRP；（8）光激活等[22]。盡管已有很多的PRP分類規則，但是仍沒有一個統一的標準，這可能也取決于PRP制作和成分的異質性。

3 PRP臨床應用

3.1 促進創面愈合與再生：PRP含有豐富的生長因子，促血管生成因子和細胞黏附分子，這些因子可以促進細胞的增殖，分化和血管生成，對愈合過程起到了積極作用。血小板及分泌的多種細胞因子參與了創面愈合的4個過程：止血、炎癥、增殖和重塑。臨床上使用PRP治愈的創面主要是糖尿病足潰瘍。糖尿病足潰瘍是血管病變、神經病變和感染綜合導致的結果，再加上壓力點的損傷最終發展成足部骨骼畸形。糖尿病足容易出現潰瘍，在糖尿病人群中發病率為4%～10%，并且復發率高，截肢率也高，導致患者生活質量顯著下降[23]。近年來，再生醫學為慢性傷口的治療提供了新的解決方案，例如PRP既可以促進免疫調節，也可以促進難以愈合的傷口組織修復。在2006年，DRIVER等在對使用PRP治療糖尿病下肢傷口的隊列進行12周的隨訪中發現，治療組19個患者中有13個患者傷口愈合（68.4%），而對照組21個患者有9個患者傷口愈合（42.9%），而且PRP治療組的平均愈合時間較對照組縮短（45天vs.85天）。除單獨使用PRP之外，研究者也將PRP與自體間充質干細胞結合以治療糖尿病足，效果良好，這也為PRP與細胞治療的聯合應用提供了新的依據[24-25]。

PRP不僅對糖尿病潰瘍有積極的療效，也可以促進周圍神經的再生。周圍神經是由髓鞘和非髓鞘的感覺，運動和自主神經軸突束組成的離散的球根器官。在發生周圍神經損傷后，將發生多細胞多分子反應。神經元細胞核移位，細胞質發生嗜酸性改變，合成信使RNA和大量蛋白等物質為修復做準備。周圍施旺細胞大量增殖，巨噬細胞吞噬軸突碎片和崩解的髓鞘，大量施旺細胞分泌神經營養因子促進軸突的生長，將其與目標器官重新連接[26]。由此可見在周圍神經損傷修復的過程中，神經元需要多種生長因子的協助從而促進細胞的增殖和遷移。PRP可作為輔助周圍神經損傷修復的一種治療方法。越來越多的體內外實驗證據表明，PRP及其所含有的纖維蛋白支架不僅具有神經保護的作用，而且還可以作為感覺和運動功能神經肌肉單位恢復的增強劑[27-29]。ZHENG等研究者發現濃度為2.5%～20%的PRP可以刺激施旺細胞的增殖和遷移，誘導神經營養因子包括神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和膠質源性神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）的產生[3]。PRP也可以通過IGF-1和VEGF相關機制促進脊髓組織中的軸突生長，并且PRP中的TGF-β1抑制了神經元軸突的生長[30]。PRP可以改善損傷部位的周圍微環境，克服炎癥反應并且刺激血管生成[31]。在膝關節炎的治療中，關節內和骨內聯合注射PRP具有免疫調節和抗炎作用，這可能與HGF，IGF-1，PDGF和TGF-β等生物活性因子有關[32-33]。PRP誘導的血管生成在擴大新生血管灌注能力和減輕嚴重骨骼肌缺血后內源性組織纖維化方面具有有效的功能[34]。KIM等研究者在大鼠坐骨神經缺損的模型中發現填充PRP的自體內向外的靜脈移植對大鼠坐骨神經功能的改善優于對照組[35]。以上結果都提示我們PRP對于周圍神經損傷修復起到了積極的作用。

雄激素性脫發（androgenetic alopecia，AGA）又稱脂溢性脫發，其主要病理表現是進行性毛囊微小化，遺傳因素和雄激素作用是主要致病因素[36]。近年來由于社會競爭壓力增大，不良的生活作息都導致AGA患者逐漸增多。而脫發區注射PRP也已被用作AGA的治療。有研究結果顯示血小板釋放的生長因子可能會作用于卵泡膨出區域的干細胞，刺激卵泡的發育，促進新生血管的形成[37]。PRP誘導的抗凋亡調節因子和信號通路的激活，如Bcl-2蛋白和ERK/AKT信號通路等都延長了細胞的存活[38]。除此之外，PRP作用下的成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor 7，FGF-7）/β-catenin信號通路也誘導了干細胞的分化，延長了頭發的生長周期，從而促進了頭發的生長[39]。PRP成分中的VEGF和PDGF也可以刺激脫毛區血管的生成[40]。Rinaldi等研究者發現PRP治療的患者組頭發比曲安奈德藥物治療組頭發生長顯著增加。研究者在研究開始、2個月、6個月和12個月這4個時間節點對所有患者采用SALT評分，即由3名對治療方式不知情的獨立評估者進行評估，患者對灼燒/瘙癢的感覺進行主觀評估，研究者使用皮膚鏡觀察及檢測細胞增殖標志物Ki-67的水平，綜合上述指標評估患者頭發再生程度。曲安奈德藥物治療的患者中有27%的患者在12個月時完全緩解，而PRP治療的患者中有60%的患者完全緩解，PRP能增加頭發再生，減少頭皮灼癢的感覺，細胞增殖標志物Ki-67的水平顯著升高，這些指標都明顯高于曲安奈德藥物治療和安慰劑治療的患者。在6個月時，曲安奈德藥物治療組中38%的患者已有脫發斑塊的出現，而PRP組中的患者在此時間點均未發現有脫發斑塊。在12個月時，曲安奈德藥物治療組中71%的患者出現疾病復發，而PRP組中只有31%的患者復發。而PRP組中96%的患者從在頭發生長的開始階段重新長頭發，曲安奈德藥物治療組中只有25%患者在頭發生長的開始階段重新長頭發[41-42]。現有越來越多的臨床試驗研究PRP再生及修復的治療效果，但是仍需更大樣本，更長時間隨訪的臨床試驗研究來進一步證明PRP的有效性和安全性。

3.2 治療眼科疾病：干眼癥（dry eye disease，DED）是最常見的眼部疾病之一。近年來，由于老年人口、長期面對電子產品的工作人員的增多，同時伴隨隱形眼鏡的廣泛應用都導致干眼癥的發生率持續增高[43]。傳統的干眼治療包括人工淚液或者糖皮質激素控制癥狀，例如眼部灼燒、刺痛和異物感，但是不能修復受損傷的部位。自體血清（autologous serum，AS）已被建議作為重度干眼癥的治療方法。AS中含有EGF、維生素A、IGF、α2-巨球蛋白和促炎細胞因子等，表現出優于人工淚液的優勢。而PRP因其含有高濃度血小板和極少量的其他物質，則更優于AS。自體PRP和人工淚液治療中度至重度干眼對比研究發現，自體PRP組治療前后的眼表疾病指數和角膜熒光素染色評分比較差異有統計學意義，并且干眼癥主觀癥狀評分下降，一個療程后，自體PRP治療組的有效率高于對照組，結果顯示PRP能夠改善中重度干眼癥患者眼部不適等癥狀[43]。在體外培養試驗中發現，PRP可以促進貓角膜內皮細胞的增殖能力，呈劑量依賴性[44]。雖然這種經PRP處理后的角膜內皮細胞的生物學性狀有待進一步的研究，但是也推動了角膜內皮病變的治療。

3.3 骨科疾病：PRP因其優良的促進組織細胞再生等優點被廣泛應用于骨科的臨床治療。近年來，關于骨關節炎、軟骨組織病變和韌帶修復等多種疾病均有PRP應用的研究報道。PRP主要的適應癥包括骨折、骨缺損、肌腱損傷、創面、關節內軟骨損傷和骨關節炎等，還可用于骨髓炎和股骨頭壞死的輔助治療[45]。

骨骼的愈合和重塑是由多種細胞因子參與的過程，主要包括骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），VEGF，TGF-β，PDGF，FGF和IGF[46]。而含有這些因子的PRP可以加速骨骼的愈合。在體外試驗中，PRP可以通過AKT和Notch-1信號通路促進骨髓間充質基質細胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BM-MCSs）的增殖，二者聯合應用比單獨使用PRP更有效[47]。有研究發現骨髓間充質干細胞經過PRP和磷酸鈣粒子處理后Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白和骨鈣素的表達升高，促進干細胞向成骨方向分化，加速骨的再生[48]。并且，PRP還可以促進干細胞向肌腱方向分化，加快肌腱的修復[49，50]。除了促進細胞的增殖和分化，體外PRP聯合抗炎藥物也發揮了重要的作用。肌腱邊緣的旋轉軸細胞經過白介素1β誘導而處于一種炎性環境，實驗組中細胞單獨使用抗炎藥物-曲安奈德處理后雖然會下調炎性基因但是也會上調退行性基因，而聯合使用PRP和曲安奈德的細胞中炎性基因和退行性基因的表達均下降，既發揮了抗炎作用也發揮了抗退化的作用[51]。除了在骨再生和骨關節炎中的應用，在肌腱愈合過程中PRP也發揮著重要作用，一方面刺激細胞外基質的表達，另一方面也促進干細胞向肌腱細胞的分化[52]。在創面及軟骨損傷修復過程中，PRP也能起到加速傷口愈合，減輕炎癥，緩解疼痛的作用，最終促進了骨與軟組織的修復[45]。

4 PRP應用的局限性 雖然體外細胞實驗數據支持 PRP具有促進細胞的增殖、分化、細胞外基質合成等作用，但是PRP的臨床效益尚未得到普遍實現，各種臨床研究結果之間存在異質性，提示我們PRP應用可能存在一定的局限性。患者年齡、PRP的制備、PRP的細胞組成、應用頻率和次數、評價方式等多種因素都可能會產生臨床異質性[45]。PRP的制備首選成分血單采機制備，但是部分醫院仍多采用PRP專用套裝制備方法，這種制備方式多樣可能也導致PRP制品的質量難以保證。除了制備方式的不統一，PRP自身成分的復雜性和可變性也是導致臨床異質性的原因之一。PRP經過凍存-復蘇過程后其中細胞因子可能會發生衰減，影響治療的有效性。如何及時準確的檢測PRP中生長因子等活性物質也是其臨床應用的難點。PRP中的白細胞濃度取決于PRP的制備方法，關于白細胞的存在對PRP發揮抗炎作用的爭論很多，這也是研究者對于PRP安全性的考慮之一。PRP中纖維蛋白的形成有助于修復受損血管壁，防止組織進一步出血，而這種纖維蛋白立體結構的觀察目前也沒有快速簡單的檢測方法。因此，PRP的制備方法和其最終成分的異質性都會影響產品應用的功效。除了PRP自身特性之外，患者自體的生理及病理特征也可能影響PRP的效果，因此PRP的應用和適應癥應由臨床醫師根據患者的治療需求決定。

5 小結與展望 隨著血細胞分離技術的快速發展，PRP正成為快速治療各類疾病的新興手段。血細胞分離機采集PRP的安全性更高，血小板濃度更穩定，在未來PRP臨床應用中覆蓋領域會更廣。雖然PRP應用研究較多，但是有些研究尚有無效甚至較差的臨床療效，這可能也受限于較少的樣本數。因此，對于PRP的定義、操作手段、患者的療效評估方法等都需要進一步的規范化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突