基因轉染技術在抗肝纖維化中應用的研究進展▲

艾丁丁 羅偉生

(廣西中醫藥大學脾胃科，南寧市 530000，電子郵箱:378621449@qq.com)

【提要】 基因治療是指將外源性正?；驅氚屑毎灾委熂膊〉囊环N方法，現階段主要運用于腫瘤及某些特殊疾病的治療。有研究顯示，將基因治療的轉染技術用于抗肝纖維化的治療可以逆轉纖維化，或可成為治療肝纖維化的潛在方案。本文就基因轉染技術在抗肝纖維化中應用的研究進展進行綜述。

肝纖維化是肝炎發展到肝硬化、肝癌的中心環節，在肝纖維化過程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的增殖與抑制是逆轉肝纖維化的關鍵。而肝纖維化既是一個病理進展過程又是一個可逆性疾病，同時存在于慢性肝病發生、發展和修復的過程中。通過轉染技術干預HSC細胞的增殖來抑制肝纖維化，是近年來治療肝纖維化疾病的新方向。本文就基因轉染技術用于肝纖維化治療的研究進展做一綜述。

1 基因治療的概述

基因治療是一種將同種健康遺傳分子物質導入患者細胞以取代異?；虻男滦椭委煼椒?，屬于非常規治療手段，其通過改變病體原有的基因產物以達到目的基因產物正?；哪康?。治療過程主要是借助必要的載體將遺傳物質導入有缺陷的組織或細胞的指定位置，使其產物對相應基因進行矯正、置換或增補，以預防或治療某種疾病[1]，其中，基因轉染技術是基因治療的一種方法，也是影響治療效果的關鍵[2]。

2 轉染技術的概述

基因轉染技術是一種將遺傳物質定向、定點傳輸入靶目標生物體的方式，轉染技術能使遺傳信息得到高效的、完整的保存和應用，是基因治療的關鍵。主要分為病毒感染法和非病毒轉染法，非病毒轉染法中的基因轉染因操作簡便而更為常用，但病毒仍是最常見的基因治療導入載體。

2.1 病毒感染方法 根據載體的特點病毒感染方法可分為逆轉錄病毒載體法和慢病毒載體法。近年來，慢病毒載體法成為基因治療研究的熱點，如何提高轉染的穩定性、普適性和轉染率是學者們關注的焦點。

2.1.1 逆轉錄病毒載體法：RNA病毒是逆轉錄病毒載體法的主要載體，在逆轉錄下以單鏈RNA載入病毒后形成雙鏈DNA，最終整合為原病毒。逆轉錄病毒載體易于制備，Kang等[3]的實驗研究表明，慢病毒介導的CNN2shRNA轉染到SK-hep-1細胞后對細胞表達的蛋白進行定向修飾，能有效抑制腫瘤細胞的增殖。但逆轉錄病毒(RNA病毒)的病毒載量小、轉化效率低，使逆轉錄病毒載體法的應用受限，因此，如何提高轉化效率是目前有待攻克的技術性難題。

2.1.2 慢病毒載體法：慢病毒載體法主要是以腺病毒相關病毒為主要載體，具有轉染率高、靶向性好等優勢，其在基因治療腫瘤中的應用已成為近年來的研究熱點。Doggybone DNA(dbDNA)是一種新型DNA，其適配的功能性的慢病毒載體可以用于體內外的遺傳信息傳遞，但以此法制作的慢病毒載體成本較高，因此，大量高質量DNA的生產仍然是基因治療中病毒載體生產的主要瓶頸[4]。

2.2 非病毒轉染方法 非病毒載體法是指用化學、物理或生物方法將正?；驅氚屑毎姆椒╗5]，該方法操作相對簡單，有較高的轉染率，比較適合初學者。有學者研究發現，陽離子脂質體載體的微循環DNA復合體可以在保持原有細胞活力的前提下提高視網膜原代細胞和大鼠視網膜細胞的轉染率[6]。非病毒轉染法主要包括化學、生物和物理轉染法。

2.2.1 化學轉染法:化學轉染法主要有陽離子法、磷酸鈣共沉淀法和脂質體轉染法，其中磷酸鈣共沉淀法僅用于實驗性基礎研究的開發。Reinhard等[7]采用陽離子脂質低聚物進行轉染實驗時發現，優化裂解方案可以最大限度地減少三氟乙酸加合物的形成，從而提高合成的效率。因化學轉染法的轉染率低而運用受限，但與其他方法聯合使用可提高活體內的轉染率，如將化學轉染法和物理轉染法合并使用的TurboFect試劑轉染聯合機械轉導聯合轉染方法,能有效增強腫瘤細胞中的基因載體傳遞[8]。

2.2.2 生物、物理及其他轉染方法:近年來，非病毒轉染方法中的生物和物理轉染法較為常用，其中受體介導的基因轉移法和直接注射法是近期研究的熱點。生物轉染法中，受體介導的基因轉移法使用的質粒DNA與載體形成的復合體大多能被肝臟攝取，因此該轉染法更適用于慢性肝病的轉染治療，但該復合體在活體內持續表達的時間較短導致該轉染法使用受限。最新研究表明，引入基因治療增強劑可以增強生物材料支架系統的傳遞潛力，如活化的聚酰胺酰胺樹狀大分子轉染試劑配合特定的復合支架可用于各種組織缺陷的再生治療[9]，這使得生物轉染法的應用取得新的進展。物理轉染法較為直接，如顯微鏡注射法是在顯微鏡下利用外源性基因直接注射入細胞，該方法適合靶基因在肌肉、肝臟和脾臟等細胞中的表達培養，如基于納米通道陣列平臺進行細胞培養的基因治療[10]。

3 基因轉染技術在肝纖維化中的應用

隨著基因轉染技術的逐漸成熟化，該技術在肝纖維化、肝硬化和肝癌等慢性肝病中的治療成為可能。目前，將基因轉染技術應用于抗肝癌或抑制肝纖維化是基因轉染技術在慢性肝病研究中應用的首要突破口。而尋找活體內的可行性、最高效的基因轉染關鍵靶點是提高基因轉染治療效果的關鍵。有研究顯示，暫時性膽道阻塞可以提高基因轉染治療的效果，并且肝膽道可能是基因治療的重要給藥部位[11]。

3.1 基因轉染調控蛋白抗肝纖維化 Xu等[12]成功構建重組pIRES2-EGFP-ARTS質粒并將其轉染入活化的人LX-2 HSC，結果顯示ARTS過表達可能是潛在的逆轉肝纖維化的新型治療手段，使基因轉染治療肝纖維成為可能。有研究顯示，丙型肝炎病毒蛋白具有多種調節細胞死亡的機制并可促進細胞自噬，該發現可能使丙型肝炎病毒蛋白成為預防或治療丙型肝炎病毒相關肝纖維化、肝硬化或肝癌的病理靶標[13]。在小鼠肝纖維化模型中，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)-30a過表達后可直接抑制Beclin1介導的細胞自噬來預防肝纖維化，miRNA-30a成為潛在的抑制肝纖維化發展的新靶點[14]。由此可見，基因轉染技術主要通過調節某些分子機制來改變上游蛋白的表達，從而直接逆轉肝纖維化的發展，并通過相關信號通路間接抑制肝腫瘤細胞的增殖。

3.2 基因轉染調控HSC活化抗肝纖維化 HSC是肝纖維化發生發展的關鍵環節，細胞本身的活化和抑制是防治肝纖維化的關鍵，目前，免疫調節劑、受體等對HSC的調節成為基因治療肝纖維化的研究熱點。核苷酸結合寡聚化域樣受體5是寡聚化域樣受體家族的最大成員，被確定為能夠影響肝纖維化發展的免疫反應關鍵調節劑，因此，寡聚化域樣受體5或可通過調節逆轉錄過程HSC活化蛋白的差異表達來逆轉肝纖維化[15]。有研究顯示，腱生蛋白C是一種細胞外基質糖蛋白，其在肝纖維化過程中表達上調，并且隨著HSC的激活其表達水平升高，而給予過表達的pTARGET-腱生蛋白載體轉染后，HSC的活化有所增強[16]。有研究表明，相關蛋白是人體重要的功能性下游蛋白，其在活化的HSC中表達降低有助于獲得HSC的靜止表型，且其可能是HSC活化和逆轉肝纖維化的新標靶途徑[17]。還有研究顯示，miRNA-942靶向過氧化物酶體增殖物激活受體γ能降低人肝纖維化中HSC的活化[18]。因此，采用基因轉染方法調節過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達可能是治療慢性乙型肝炎性肝纖維化的新策略。

3.3 基因轉染調控信號通路抗肝纖維化 近年來，有學者采用基因轉染技術對信號通路進行調控來抗肝纖維化，如采用基因轉染技術對轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信號通路、經典的Wnt信號通路和Smad3經典信號轉導途徑等與生長和發育相關的重要信號通路進行干預。有研究表明，miRNA-29b與TGF-β1/Smad3信號通路之間的反饋環是一種惡性循環，而miRNA-29b對TGF-β1誘導的LX-2細胞(人類HSC細胞)活化具有抑制作用，因此，對此反饋環進行負向調節可能是抗肝纖維化的方法之一[19]。還有研究顯示，移植uPA基因修飾的骨髓間充質干細胞可以抑制被CCL4誘導的肝纖維化大鼠的肝纖維化、改善肝功能，其可能成為治療肝纖維化的一種新方法[20]。Notum(一種新發現的蛋白抑制劑)通過下調Wnt5a介導的非經典途徑也可以抑制乙型肝炎病毒誘導的肝纖維化[21]。以上文獻提示，采用基因轉染技術對常見的信號轉導途徑進行干預均可抗肝纖維化，但相關研究結果在臨床上應用還需要大規模、多樣本的臨床研究結果支撐。

3.4 基因轉染保護肝細胞發揮抗肝纖維化作用 肝細胞凋亡是許多肝臟疾病發生、發展的主要特征之一，而保護肝細胞并抑制其凋亡的主要作用是改變肝細胞的自身狀態，如降低肝細胞的基礎代謝，改變細胞外基質對肝細胞的作用。研究證實，采用染色體10上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物腺病毒進行基因治療或為抗肝纖維化的治療方法之一[22]。另有研究顯示，靶向法尼醇X受體可抑制肝纖維化中肝細胞的凋亡[23]，這使得臨床利用基因轉染技術抑制肝細胞凋亡與衰老從而抗肝纖維化成為可能。通過細胞外基質調節干擾素信號傳導和HCV-RNA的復制可減少肝纖維化物質的累積[24]，據此或可研發一種抑制并逆轉肝纖維化發展的新藥物。

總之，采用基因轉染技術保護肝細胞或為臨床最直接、最簡單的抑制肝纖維化進程的途徑，而從細胞內環境和細胞代謝等方面保護肝細胞，是未來研究的新方向。

4 小 結

目前，基因治療技術發展迅速，尤其是基因轉染技術在多學科交叉層次的研究逐漸深入，其在肝臟疾病的診斷和治療方面也取得一定成效，轉染技術在抗肝纖維化治療中的用藥靶點和信號通路機制研究均有突破性進展。但基因轉染技術也有其局限性，如非病毒轉染法存在轉染率低的問題，將來還需進行多方面的基礎實驗研究以提高基因轉染技術的轉染率。