彌漫大B細胞淋巴瘤中外泌體的研究與應用進展

王悅，王樹葉

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院血液內科，哈爾濱 150001)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是危及生命的、有顯著生物學異質性的非霍奇金B細胞淋巴瘤，占所有非霍奇金淋巴瘤的30%～35%[1-2]。雖然它是一種潛在的可治愈的惡性腫瘤，但大多數患者無法通過補救療法(包括自體干細胞移植)治愈，約1/3的患者會發展成復發性/難治性DLBCL(relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma，R/R DLBCL)[3-4]。DLBCL的預后由患者特征、腫瘤負荷、生物學行為、腫瘤微環境和治療效果共同決定[5]。因此，對患者結果的準確預估有助于DLBCL的個體化治療，既往對DLBCL患者預后及治療效果的評估通常采用國際預后指數(international prognostic index，IPI)[6]。但隨著免疫治療時代(利妥昔單抗的出現)的到來，IPI已不再具有絕對權威性，同時由于腫瘤異質性的存在，IPI相似患者的預后也可能不同。近年來，外泌體作為一種“液體活組織檢查”物質被廣泛研究，尤其在血液系統惡性腫瘤DLBCL方面，可通過檢測患者外周血甚至體液外泌體的含量評估患者的治療反應及預后，具有較好的臨床應用價值。對于R/R DLBCL患者，外泌體在免疫治療以及作為藥物載體遞送抗腫瘤藥物方面的應用顯示出巨大潛力。外泌體在評估患者治療反應、預后以及探索R/R DLBCL新的治療方法方面均有重要意義。現對DLBCL中外泌體的研究與應用進展予以綜述。

1 外泌體的概述

1.1外泌體的結構 外泌體是幾乎所有生物活性細胞均可產生的微小囊泡，是細胞與細胞之間通訊的關鍵信使[7]。外泌體是一種存在于多囊體中的分泌小泡，直徑30～100 nm，能與細胞膜融合釋放到微環境中[8]。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞產生的外泌體稱為腫瘤細胞衍生外泌體(exosomes derived from tumor cell，TEX)或腫瘤源性外泌體，同時腫瘤相關抗原也在外泌體上。TEX是腫瘤細胞與微環境相互作用的重要媒介，通過共享遺傳信息或功能蛋白改變細胞生物學功能。TEX由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞、血管和細胞外基質構成，其功能隨自身構成的動態變化而變化。因此，外泌體可作為細胞排泄無用或有害RNA和蛋白質的主要途徑，并可作為重要信使和載體，改變其他細胞在正常生理和疾病狀態下的功能。

1.2外泌體的功能 血液系統惡性腫瘤的發生發展過程長期且復雜，受到多種機制、多種因素的共同影響，腫瘤細胞產生的外泌體在該過程中發揮重要作用，尤其在DLBCL中。

1.2.1介導細胞通訊 外泌體是生物活性細胞分泌的納米大小的囊泡，其周圍環繞脂質雙層，攜帶多種生物分子(蛋白質、脂質、核酸等)。當外泌體被其他細胞吸收時，其所攜帶的多種生物分子被轉運并影響受體細胞的表型，因此，外泌體被認為是細胞間通訊的重要媒介，主要通過下述3種方式發揮通訊介導作用：①不同細胞表面受體與外泌體攜帶的配體結合，與兩個細胞相互作用時情況相似，但細胞間不直接接觸。②外泌體與靶細胞膜結合，攜帶“新的”表面分子，獲得新的黏附特性。③外泌體與靶細胞融合，交換膜蛋白和胞質溶膠。細胞間通訊是腫瘤發展和轉移的關鍵，T細胞產生的γ干擾素能上調腫瘤細胞表達程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)，而PD-L1鑲嵌于內吞途徑產生的外泌體上，并與細胞膜融合釋放至微環境。含有PD-L1的較大微泡可以從細胞表面以出芽方式產生，外泌體可與腫瘤微環境中的部分細胞相互作用，也可以進入血液循環與遠處細胞相互作用。值得注意的是，外泌體不僅有原發性腫瘤微環境中的局部信號，還有腫瘤向轉移部位發出遠程信號，以促進適宜的轉移前生態位的形成，該生態位能夠運輸和轉移生物活性分子，將在播散性腫瘤細胞到達時促進腫瘤生長[9-10]。雖然外泌體可通過細胞與細胞間的交流、胞膜與胞膜的融合以及表達相應蛋白等促進腫瘤的發生發展，但其在DLBCL上介導細胞間通訊的具體機制尚不清楚。

1.2.2外泌體重編輯骨髓 骨髓造血微環境是血液系統惡性腫瘤發病機制的重要因素之一，腫瘤細胞可利用外泌體作為生長因子、細胞因子、酶、血管生成分子和遺傳物質的載體來重新改造骨髓微環境，以促進血液系統惡性腫瘤的發生。Peinado等[10]首次證實，TEX可作為破壞造血干細胞以及正常細胞造血功能的新的生物因子，而黑色素瘤衍生的外泌體可通過介導MET癌蛋白的轉移“指引”骨髓造血干細胞支持黑色素瘤的生長和轉移。Kumar等[11]的研究表明，急性髓系白血病源性外泌體通過上調DKK1(一種正常造血和成骨的抑制劑)將骨髓培養成適合白血病細胞生長和抑制正常造血的微環境。骨髓間充質干細胞可以接收成人T細胞白血病/淋巴瘤源性外泌體的相關基因，激活核因子κB通路，從而造成白血病細胞增殖、遷移和血管生成。此外，慢性髓系白血病患者外周血還可釋放雙調蛋白的外泌體，并通過其激活表面生長因子受體進而重編輯骨髓，導致慢性髓系白血病的發生。因此，外泌體通過其產生的基質直接或間接地抑制骨髓微環境、重新編輯骨髓微環境，進而抑制正常造血功能，并為腫瘤細胞提供生長、增殖、轉移的有利環境。

1.2.3外泌體參與免疫逃逸 腫瘤患者體內的腫瘤細胞需要經歷各種轉化，以躲避機體的免疫監測。由于TEX中含有腫瘤特異性抗原等物質，能夠參與腫瘤細胞的免疫逃逸[12]，外泌體在免疫系統中發揮信號作用，可將未成熟樹突狀細胞上的主要組織相容性復合體分子轉移到其他樹突狀細胞，從而激活免疫反應。TEX介導免疫抑制可通過結合受體細胞膜表面分子激活或抑制相關蛋白受體發出信號并啟動下游通路。TEX上有較多自然殺傷細胞活化型受體NKG2D的配體，故可通過降低自然殺傷細胞活化型受體NKG2D的數量影響自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞和細胞毒性T細胞的功能[13]。TEX還可以導致T細胞功能受損，使受外泌體影響的T細胞在腫瘤抗原的持續刺激下上調程序性細胞死亡受體-1、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4和B/T淋巴細胞弱化因子，并激活Fas/FasL途徑誘導T細胞凋亡，引起DLBCL[14]。外泌體表面的PD-L1與腫瘤進展有關，攜帶免疫抑制蛋白PD-L1的TEX，可使免疫細胞喪失活性，使其不能識別和殺傷腫瘤細胞。此外，致癌病毒也可以利用外泌體調節細胞微環境，逃避免疫系統的識別并加速腫瘤進展，從而使病毒誘導的淋巴細胞瘤復雜化[15-16]。免疫監控是人體避免腫瘤發生的關鍵調控機制，目前外泌體可通過自身特性調節自身囊泡表面所分泌的物質，使腫瘤細胞逃避人體正常的免疫監控及免疫清除機制，這有助于尋找免疫逃逸過程的關鍵點，針對其研發出特定的靶向藥物，以避免腫瘤的進一步發展。

1.2.4外泌體參與重塑微環境 微環境是生物體細胞生存的基本環境，其穩態是維持細胞正常生長、增殖、分化和代謝的正常條件，微環境的重塑是腫瘤發生發展的一個關鍵因素。淋巴瘤源性外泌體含有參與抗原呈遞的蛋白質，腫瘤細胞可將外泌體作為細胞因子、血管生成因子和遺傳物質等載體重塑腫瘤微環境。外泌體與靶細胞質膜融合后，以不同方式促進功能和表型改變，重塑適應疾病進展的微環境。骨髓間充質干細胞內吞淋巴瘤外泌體后，產生CC趨化因子受體2招募大量巨噬細胞，進而促進淋巴瘤的生長[17]。MYD88突變的淋巴瘤B細胞衍生的外泌體能夠觸發肥大細胞和巨噬細胞中促炎信號的激活，將腫瘤微環境重新編程為腫瘤促進子，改變微環境導致腫瘤發生。在EB病毒陽性DLBCL中，TEX攜帶的EB病毒來源的非編碼RNA能夠被單核巨噬細胞吞噬，促進腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-10、Arg1基因的表達，導致巨噬細胞變化，淋巴增生性疾病的加重[18]。同時，腫瘤可通過其所分泌的外泌體改變其自身代謝，使其重編程，并向腫瘤細胞提供存活所需的物質，以促進腫瘤細胞生長。TEX通過抑制抗腫瘤免疫反應，或通過促進腫瘤轉移過程中血管生成或腫瘤向身體其他部位的遷移促進腫瘤生長。綜上，外泌體可通過釋放、誘導產生與DLBCL相關的炎癥介質等細胞因子促進間充質干細胞增殖，進而促進DLBCL進展。

1.2.5外泌體抵抗化療藥物 在接受一系列治療后，DLBCL患者短期內進入復發/難治階段，這在很大程度上源于腫瘤對化療藥物的耐藥。研究表明，DLBCL來源外泌體可通過轉移多藥耐藥蛋白和微RNA(microRNA，miRNA/miR)、輸出殺腫瘤藥物及中和抗體藥物來影響耐藥性，在前列腺癌治療上，外泌體可誘導腫瘤對多西他賽等化療藥物產生耐藥，導致腫瘤進展[19-20]。在Qin等[21]的研究中，順鉑耐藥的肺癌細胞釋放的外泌體，通過下調miR-1005p誘導受體細胞耐藥，進而增加哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達，表明外泌體可通過調節細胞因子等誘導腫瘤對化學藥物的耐受性。一項關于B細胞淋巴瘤的研究表明，外泌體可能參與細胞中阿霉素和像素酮的輸出，且吲哚美辛對ATP結合盒轉運體A3的消耗抑制了外泌體的生物發生，并增強了藥物的核捕獲，增加了其對DLBCL細胞系的細胞抑制功效，提示可通過靶向外源性生物合成來克服化療耐藥性并提高藥物療效[22]。TEX使癌細胞能夠調節自身周圍環境，其攜帶生存和增殖信號分子，協助腫瘤免疫逃避并獲得耐藥性，外泌體介導藥物外排減少并減緩抗癌藥物的滲透，進而影響疾病的發生發展。由此可見，在DLBCL治療上，可通過減少外泌體釋放降低腫瘤對化療藥物的抗性，盡可能發揮化療藥物的療效，以延長DLBCL患者的無進展生存期，并提高治療的總有效率。

2 外泌體在DLBCL中的應用

2.1DLBCL生物標志物 外泌體被認為是“液體活組織檢查”的成熟形式，富含各種生物流體，可實現腫瘤的無創性早期診斷、預后及治療反應評估。外泌體miRNA和蛋白質是一種有效方法[23]。有證據表明，外泌體可作為血液系統腫瘤的監測指標[24]。R/R DLBCL患者、對化療藥物有良好反應性患者、健康成人之間的外周血外泌體含量有顯著差異[25]。Zare等[26]的研究發現，外泌體miR-155、let-7g和let-7i可能作為評估接受標準化療DLBCL患者治療反應的潛在預后指標。Higuchi等[18]的研究認為，BamHI片段miRNA或可成為EB病毒陽性DLBCL的一種診斷標志物，含有BamHI片段miRNA的外泌體可能成為一種有前途的診斷工具和B細胞淋巴瘤治療的新靶點。一項研究報道，包括血漿囊泡在內的miRNA水平可反映單個經典型霍奇金淋巴瘤患者的存在、治療反應和復發[27]。Hong等[28]報道，與健康對照組相比，確診且未治療急性髓系白血病患者血漿中衍生的外泌體蛋白質和轉化生長因子-β1水平顯著增高，并在誘導治療后下降，鞏固治療期間有所上升，患者達到長期緩解后恢復正常。Peng等[29]發現，急性髓系白血病患者的治療反應和預后與外泌體表達的miR-34c-5p水平顯著相關。Allenson等[30]證實，血漿外泌體DNA可用于早期檢測惡性腫瘤患者的特異性突變。可見，外周血以及患者腫瘤組織中的外泌體均可能成為預測患者疾病進展、評估藥物療效及患者生存的生物標志物，但其臨床應用還有待深入探索。

2.2DLBCL靶向藥物新載體 在循環穩定性、免疫逃逸、毒性等方面，外泌體較其他合成藥物遞送載體(如脂質體、合成納米顆粒和重組病毒載體)更適用于藥物遞送。外泌體的“天然”特征使其成為囊泡傳遞載體的理想替代品:①外泌體的微小體積有助其在細胞間轉移；②外泌體結構和組成保護分子免受核酸酶和蛋白酶的作用；③外泌體的免疫原性和毒性相對較低；④特定表面蛋白質和脂質的存在使循環中的外泌體趨于穩定，并使其細胞和組織特異性具有趨向性[31]。外泌體能夠將“貨物”運送到其他細胞，并可改變靶細胞的基因表達、信號傳遞等功能；外泌體能夠裝載特異物質，并成為細胞間遺傳物質交換和通訊的載體。通過外泌體轉運的核糖核酸物種可轉錄成互補DNA或在受體細胞內翻譯。將外泌體作為載體的藥物可以提高特定“貨物”治療疾病的靶向性，如裝載多柔比星的外泌體用于抑制乳腺癌和結腸癌的生長，效果較為顯著。外泌體的存在可能為DLBCL患者提供一種新的治療方案，且外泌體作為藥物載體的給藥方式多樣，可靜脈注射、直接注射于瘤體內、鼻腔給藥，有利于藥物的臨床應用。新的藥物載體應較現有藥物載體具有更強的靶向性，由于外泌體的天然靶向性不強，需要通過基因工程等修飾作用增強外泌體的靶向性，以使外泌體成為新一代靶向藥物。

2.3DLBCL免疫治療新方法 腫瘤免疫治療依賴于人體自身免疫系統的功能，是一種理想的治療方式，不良反應小。腫瘤來源的外泌體含有內源性腫瘤抗原，它們與免疫系統相互作用，可為開發新的免疫治療策略提供幫助。基于此，外泌體的抗腫瘤免疫作用已用于抗癌疫苗的研發。同時，外泌體也是一種有價值的免疫治療劑，在腫瘤免疫治療的臨床前研究中有重要意義，由于B細胞和樹突狀細胞源性的外泌體負載肽或全蛋白抗原，具有誘導抗原特異性T細胞和B細胞反應的能力。Chen等[32]的研究評估了熱休克小鼠B淋巴瘤細胞源性的外泌體在誘導抗腫瘤免疫反應中的功效，證明HS-Exo可通過激活T細胞和樹突狀細胞誘導強抗腫瘤免疫應答。此外，通過激活腫瘤特異性CD4+和CD8+的γ干擾素細胞，從攜帶T細胞淋巴瘤的小鼠腹水中分離的外泌體能表達CD24和熱激蛋白90誘導腫瘤特異性體液和細胞免疫應答[33]。外泌體免疫的T細胞顯示出特異性的抗淋巴瘤細胞特點。傳統的免疫治療往往基于腫瘤組織進行，而DLBCL患者腫瘤組織取材相對困難，且局部取材可能存在腫瘤異質性，但基于外泌體而產生的免疫治療的取材可極大程度上避免局部取材異質性，因此外泌體有望成為一種新的免疫治療標志物。隨著對外泌體研究的不斷深入，針對淋巴瘤來源的相關抗原免疫治療具有可觀前景，且外泌體來源的免疫治療“新生物”具有潛在優勢。

3 展 望

在液體活組織檢查時代，TEX在DLBCL的診斷和治療等方面有巨大的應用前景。在淋巴瘤病程進展中，DLBCL源性外泌體通過改變腫瘤微環境、拮抗化療藥物、重編輯骨髓等方式影響DLBCL的進程及患者預后，并可作為淋巴瘤患者的生物標志物，預測疾病發展變化趨勢。目前，對外泌體的相關研究較多，但對其運載藥物、靶向治療以及相關機制的研究較少。此外，由于缺乏標準化的分離和定量方法，外泌體的臨床應用尚未充分開發。未來，可致力于外泌體及其相關蛋白、miRNA等在免疫治療方面的研究。